Rôle inducteur du mésoderme dans la différenciation précoce du bourgeon de membre chez l’embryon de Poulet

Le bourgeon de membre des Vertébrés est composé de deux ébauches, l’une ectodermique, l’autre mésodermique provenant d’un épaississement de la somatopleure.

Quel est, de ces deux composants, celui qui déclenche l’excroissance du bourgeon et joue le rôle de l’inducteur primaire du membre?

Cette question a été résolue chez les Amphibiens Urodèles. Les expériences de Harrison (1925,1931), de Balinsky (1931) et de Rotmann (1931) ont démontré l’action inductrice du mésoderme sur l’ectoderme sus-jacent lors de l’apparition du bourgeon de membre. Récemment, Tschumi (1957) a démontré les mêmes propriétés du mésoderme chez un Anoure (Xenopus).

Le mésoderme du bourgeon de membre des Oiseaux possède-t-il ce même pouvoir inducteur ?

On a beaucoup écrit sur les rôles respectifs du mésoderme et de l’ectoderme dans la différenciation du membre. Rappelons simplement, parmi de nombreux travaux, les recherches de Saunders (1948, 1949), Zwilling (1955, 1956) et surtout de Hampé (1957, 1959) qui ont mis en évidence le rôle actif de l’ectoderme dans la croissance et dans la différenciation des articles du membre. D’autre part, le mésoderme semble jouer un rôle non moins important puisque c’est lui qui détermine la qualité (aile ou patte) de cette différenciation. Pourtant la question de la détermination précoce et de l’induction primaire du bourgeon de membre n’a pas encore été résolue.

Les auteurs, qui jusqu’ici ont étudié le rôle du mésoderme, se sont adressés au bourgeon de membre déjà formé, tel qu’il se présente à partir du stade 18 de Hamburger & Hamilton (1951). Les résultats qu’ils ont obtenus sont contradictoires. D’une part, Zwilling (1955) montre que le mésoderme, séparé de l’ectoderme par le versène et implanté sous l’ectoderme banal situé en dehors du territoire du membre est incapable de provoquer la différenciation d’un membre. D’autre part, Bell, Kaighn & Fessenden (1959) ont montré, tout récemment, que le mésoderme du bourgeon de membre séparé de l’ectoderme par les ultrasons et implanté en greffe coelomique est capable de se différencier en articles cartilagineux et en musculature, même en l’absence de tout revêtement ectoder-mique. Ce résultat met en doute le rôle actif de la cape apicale ectodermique et se trouve ainsi être en contradiction avec les conclusions des auteurs cités plus haut. Quelles que soient les interactions entre le mésoderme et l’ectoderme au cours de la différenciation du membre, nous avons voulu préciser, par de nouvelles interventions pratiquées à un stade plus jeune, le rôle du mésoderme dans la détermination précoce du membre (Kieny, 1959).

Les expériences ont été faites sur des embryons de Poulet de la race Leghorn blanche.

Du mésoderme présomptif de membre ou du mésoderme de jeune membre est greffé dans le flanc d’un embryon, dans la région située entre l’aile et la patte. Le stade des embryons donneurs de mésoderme varie du stade 15 à 16 au stade 18 de Hamburger & Hamilton. Les embryons hôtes possèdent de 15 à 23 somites (stades 12 à 14).

Nous nous sommes servis de deux agents de dissociation, la trypsine et le versène.

Nous avons utilisé la méthode à la trypsine diluée élaborée par Moscona (1952). L’ensemble ectoderme-mésoderme séjourne dans une solution de trypsine Difeo 1:250 à 2 pour cent dans du liquide de Tyrode, pendant 2 à 5 minutes à 38° C. (Planche 1, fig. 2). Après plusieurs bains de lavage dans du liquide de Tyrode, on détache facilement l’ectoderme du mésoderme à l’aide de deux microscalpels.

La plus grande partie des bourgeons de membre a été soumise à l’action du versène. La technique employée est celle qui a été mise au point par Zwilling (1955) pour la séparation de l’ectoderme et du mésoderme: action d’une solution de versène dans du liquide de Tyrode dépourvu de Ca et de Mg pendant 20 à 30 minutes à 38° C. (Planche 1, fig. 1).

Dans quelques expériences le bain dans la solution de trypsine a été prolongé jusqu’à 30 minutes, le bain dans la solution de versène jusqu’à 60 à 70 minutes.

On détache l’ectoderme après 2 à 5 minutes dans le cas de la trypsine et après 20 à 30 minutes dans le cas du versène. Après plusieurs bains de lavage, le mésoderme est déchiqueté en une douzaine de petits fragments. Après quelques minutes les fragments réagglomérés sont greffés de la manière habituelle.

Le mésoderme obtenu après action de la trypsine ou du versène est greffé dans l’aire pellucide d’un embryon de 15 à 23 somites à égale distance des futures ébauches de l’aile et de la patte. Pour les stades les plus jeunes (antérieurs à 20 somites) on définit la région du flanc d’après la carte des territoires présomptifs de l’aile et de la patte mise au point par Chaube (1959). On pratique une fente perpendiculairement à l’axe de l’embryon à l’aide d’une aiguille de verre. On y introduit le greffon de sorte que environ du mésoderme émerge. Ainsi le mésoderme se trouve mis en contact avec la région de la somatopleure destinée normalement à former le flanc de l’embryon. Les hôtes sont sacrifiés au ll^ème jour d’incubation. Le squelette est mis en évidence par la technique de Lundvall.

Du mésoderme de membre, après action du versène, a été greffé sur la membrane chorio-allantoïdienne d’embryons de 6 à 7 jours | d’incubation. Après 7 jours, le greffon a été fixé. Le développement cartilagineux a été mis en évidence selon la technique de Lundvall.

On prélève la partie distale ou la totalité du bourgeon de membre surnuméraire induit, 30 à 40 heures après l’implantation du mésoderme. L’ectoderme est séparé du mésoderme par la technique de la trypsine diluée (voir p. 458). Le revêtement ectodermique est greffé sur un moignon de patte sectionné au niveau du genou. Cet ectoderme est maintenu en place à l’aide de deux fins crochets d’argent.

Les embryons donneurs, ayant fourni l’ectoderme apical du membre surnuméraire, ainsi que les embryons hôtes, qui ont reçu la greffe d’ectoderme, sont sacrifiés au ll^ème jour d’incubation pour permettre la mise en évidence du squelette cartilagineux.

Pour l’étude histologique, des greffons ont été inclus à la paraffine, coupés à 5 microns et colorés au glychémalun-éosine.

Dans nos premières expériences nous avons utilisé la méthode de la trypsine diluée (Moscona, 1952) pour séparer le mésoderme et l’ectoderme du bourgeon de membre. Le mésoderme de l’ébauche présumée du bourgeon de membre (stades 16 à 17) ou le mésoderme du jeune bourgeon de membre (stades 17 à 18) a été greffe dans le flanc d’embryons de 15 à 23 somites à égale distance entre la future aile et la future patte. Les résultats globaux de cette série expérimentale sont consignés dans le tableau 1. Sur les 59 embryons hôtes, qui ont vécu au-delà de 7 jours et qui permettent une bonne mise en évidence du squelette, 1 seul embryon présente une formation surnuméraire de type membre (Planche 1, fig. 3). Sur les 58 embryons restants, 22 embryons présentent, à l’emplacement de la greffe, une plage de germes plumaires bien développés et spécifiques du bassin ou du stylopode, bien que le flanc de l’hôte soit normalement dépourvu de germes plumaires à ce stade. La peau du flanc est capable de répondre à une induction du mésoderme de membre. De ces 22 embryons, seuls 10 présentent une formation cartilagineuse conforme à la valeur prospective du greffon. Cette différenciation cartilagineuse peut être plus ou moins importante. Elle peut se réduire à un minuscule osselet informe, ou par contre, elle peut représenter une partie de l’os stylopodial; dans les cas les mieux réussis le greffon provenait d’embryons de stade 18.

Après avoir obtenu uniquement des résultats négatifs avec le mésoderme soumis à l’action de la trypsine, nous nous sommes servis de la méthode de dissociation au versène préconisée par Zwilling (1955). Le stade des embryons donneurs de mésoderme varie du stade 15–16 au stade 17–18,¹ celui des embryons hôtes du stade 12 au stade 14 (44 heures d’incubation: 15 à 23 somites). Les résultats de cette série expérimentale sont résumés dans le tableau 2. Parmi les 54 embryons hôtes, qui ont vécu au-delà de 7 jours, 22 ont développé un membre surnuméraire bien formé (Planche 1, figs. 4, 5, 6, 7). Vingt-cinq des embryons restants présentent une formation cartilagineuse qui correspond simplement à la valeur prospective du greffon (Planche 1, fig. 8). Enfin, chez 7 embryons, le greffon n’a pas été retrouvé et l’hôte ne montre aucune différenciation cartilagineuse supplémentaire. Signalons cependant que 10 des 32 cas négatifs présentaient, 40 heures après l’implantation, des ébauches de membre surnuméraire, dont la palette était nantie de la vascularisation typique du bourgeon de membre de 3 jours. Rien, dans leur structure macroscopique, ne permettait de prévoir que ces différenciations régresseraient par la suite. Dans 8 cas, nous n’avons retrouvé qu’une formation cartilagineuse correspondant à la valeur prospective du greffon. Dans 2 cas l’involution a été totale.

Les 22 membres surnuméraires bien formés se sont différenciés selon la nature d’aile ou de patte du mésoderme implanté (3 ailes et 19 pattes). Tous les membres sont entièrement recouverts d’ectoderme normalement différencié en germes plumaires et en écailles.

Dans la majorité des cas, le membre surnuméraire possède 3 articles. Douze membres de type patte sont particulièrement bien constitués et les différentes pièces osseuses sont facilement identifiables. Lorsque le nombre des articles est inférieur à 3 (3 cas), l’autopode pourtant ne fait jamais défaut. Le nombre des rayons varie de 1 à 6 avec une forte proportion de pattes à 2 rayons (tableau 3).

Le membre surnuméraire est toujours orienté vers l’extérieur (Planche 1, figs. 4, 5, 6, 7). Il se trouve placé dans le même plan que les membres de l’hôte, malgré l’orientation quelconque du greffon. Il semble donc que le mésoderme, au stade où il est prélevé, ne possède pas encore de polarité bien établie. Comme le membre se différencie toujours en direction de l’ectoderme qui le recouvre, il est possible que l’ectoderme joue un rôle déterminant dans la direction de croissance du membre. Cette opinion est confirmée par les résultats de la série expérimentale suivante.

Le mésoderme dilacéré après l’action du versène conserve tout son pouvoir inducteur. On a obtenu la différenciation d’un membre surnuméraire dans la moitié des cas (Planche 2, figs. 9, 10;tableau 4). Leur orientation est la même que dans la série précédente. Il est donc raisonnable de penser que le rôle orienteur du membre revient à l’ectoderme.

Après l’action de la trypsine, le mésoderme dilacéré n’a donné aucun résultat positif.

Du mésoderme de membre de stades 15–16 à 19, après l’action du versène, a été greffé sur la membrane chorio-allantoïdienne. Il évolue, dans la moitié des cas, en formant des masses cartilagineuses globuleuses et morphologiquement indifférenciées (Planche 2, fig. 11; tableau 5).

Les bourgeons de membre témoins de cette série expérimentale, qui ont été traités au versène, mais dont l’ectoderme est laissé en place, forment des membres presque complets, lorsqu’ils sont greffés sur la membrane chorio-allantoïdienne (Planche 2, fig. 12).

Le mésoderme d’un jeune bourgeon de membre ou le mésoderme présomptif du membre est capable d’induire un membre surnuméraire, lorsqu’il est greffé sous l’ectoderme banal compris entre l’aile et la patte. L’ectoderme, sous l’influence inductrice du mésoderme greffé, participe à l’édification du membre. Nous pouvons donc conclure que le mésoderme est l’inducteur primaire du membre.

Il est important de noter que le mésoderme n’est capable d’exercer son activité organisatrice que s’il a été décortiqué après l’action du versène. Après le passage dans la solution de trypsine, le greffon ne se différencie guère et ne peut donner naissance à un membre surnuméraire.

Les expériences décrites démontrent nettement que le mésoderme est l’inducteur primaire du bourgeon de membre. Le développement de ce membre surnuméraire se fait-il comme celui du membre normal? En d’autres termes, le mésoderme greffé en dehors du territoire du membre, induit-il dans l’ectoderme banal du flanc la formation d’une crête apicale ectodermique ?

Pour répondre à cette question il suffisait de montrer que le revêtement ectodermique apical du bourgeon de membre surnuméraire possède les mêmes propriétés inductrices sur le mésoderme que la calotte apicale du bourgeon de membre normal.

Nous avons copié une des expériences particulièrement nettes de Hampé (1959): il greffe une calotte apicale d’aile ou de patte de stade 18 à 26 sur un moignon de patte de stade 20 sectionné au niveau du genou. Dans ces conditions, il obtient un membre plus ou moins complet suivant le stade de la calotte apicale greffée. Ce membre comporte toujours des orteils, souvent un tibia, un péroné et des métatarses.

L’extrémité distale du membre induit est constituée d’un bourrelet marginal ectodermique et offre l’aspect d’une véritable calotte apicale.

Le revêtement ectodermique apical du membre surnuméraire est greffé sur un moignon de patte d’un autre embryon de stade 19 à 20. Le membre surnuméraire est amputé 30 à 40 heures après la greffe du mésoderme dans le flanc, c’est-à-dire approximativement au stade 20. A ce moment, l’embryon porteur du membre surnuméraire a atteint le stade 19 à 24.

Dans tous les cas, après l’amputation de sa partie distale, le membre surnuméraire s’arrête de croître et ne différencie jamais son squelette distal (Planche 2, fig. 13). Trente-quatre greffes ont été réalisées. Vingt-six embryons ont vécu au-delà du 8^ème jour d’incubation et 6 d’entre eux présentent sur le membre opéré des différenciations distales de type patte (fig. 1 ; Planche 2, fig. 14). Dans 4 cas, la patte reconstituée possède 3 articles. Dans les 2 autres cas, l’orteil qui s’est développé n’est pas raccordé au squelette axial.

Ces expériences démontrent nettement que les propriétés du revêtement ectodermique du membre surnuméraire sont équivalentes à celles de la calotte apicale d’un membre normal.

Nous pouvons donc conclure que le mésoderme greffé en dehors du territoire du membre, induit dans l’ectoderme banal du flanc, la formation d’une calotte apicale active.

Nous avons greffé du mésoderme du territoire présomptif du membre (stade 15 à 16 jusqu’au stade 17 à 18) sous l’ectoderme latéral d’embryons de 15 à 23 somites. Le greffon est implanté entre les futures ébauches de l’aile et de la patte.

Dans ces conditions, environ 40 pour cent des greffons mésodermiques provoquent le développement d’un membre en induisant dans l’ectoderme la formation d’une calotte apicale. Cette calotte apicale a les mêmes propriétés inductrices sur le mésoderme sous-jacent que la calotte apicale d’un membre normal. La différenciation des articles distaux ne se réalise pas en l’absence d’ectoderme. De plus, la calotte apicale est capable d’induire dans un moignon stylopodial la formation d’un membre à 3 articles.

Les résultats négatifs de Zwilling nous font penser qu’au stade où il opère (72 heures) l’ectoderme a peut-être perdu la capacité de répondre à l’induction mésodermique.

Nous pouvons donc conclure:

• (1) que l’ectoderme situé en dehors du territoire membre peut contribuer à l’édification d’un membre, lorsqu’il a été soumis à l’action inductrice primaire du mésoderme de membre;

• (2) que l’ectoderme réagit en formant une calotte apicale, qui, à son tour, exerce une action inductrice sur le mésoderme sous-jacent.

1. Du mésoderme de l’ébauche présumée du bourgeon de membre (stades 15 à 16 et 17 de Hamburger & Hamilton) ou du mésoderme d’un très jeune bourgeon de membre (stades 17 à 18) est séparé de l’ectoderme après action de la trypsine ou du versène et greffé dans l’aire pellucide d’un embryon de 15 à 23 somites (stades 12 à 14). Le mésoderme se trouve en contact avec la région de la somatopleure destinée normalement à former le flanc de l’embryon compris entre l’aile et la patte.

2. Le mésoderme, après passage dans la solution de trypsine, a provoqué la formation d’un membre surnuméraire dans 1 cas sur 59 seulement (Planche 1, fig. 3).

3. Après l’action du versène, le mésoderme implanté induit la formation d’un membre surnuméraire dans 22 cas sur 54 (Planche 1, figs. 4, 5, 6, 7). Même après dilacération, le mésoderme induit encore des membres surnuméraires (Planche 2, figs. 9, 10). Tous ces membres surnuméraires sont recouverts d’épiderme, poussent vers l’extérieur et se trouvent placés dans le même plan que les membres de l’embryon hôte.

4. Des greffons témoins de mésoderme sur la membrane chorio-allantoïdienne forment quelques amas cartilagineux informes ; leur différenciation n’est en aucun cas supérieure à la valeur prospective du mésoderme greffé (Planche 2, fig. H).

5. L’ectoderme du flanc, sous l’influence inductrice du mésoderme, participe à l’édification du membre surnuméraire en différenciant une calotte apicale qui possède les mêmes propriétés que la calotte apicale d’un membre normal (fig. 1 ; Planche 2, fig. 14).

6. Le mésoderme de l’ébauche de membre est l’inducteur primaire du membre.