Dans le cadre des recherches consacrées à l’étude de l’apparition des constituants spécifiques de l’adulte au cours du développement embryonnaire, les méthodes immunochimiques ont trouvé un emploi toujours grandissant pendant les 15 dernières années. Le nombre de travaux, dont les principaux ont été récemment exposés (Croisille, 1958), permet de juger combien l’emploi de ces méthodes s’est révélé fructueux dans ce domaine. La plupart des auteurs ont utilisé les méthodes immunochimiques classiques: réaction à l’interface, épuisement des anti-sérums, techniques de précipitation en milieu gélifié et réaction de déviation du complément. Mais ces méthodes ne permettent souvent pas, malgré leur spécificité et leur sensibilité, de dénombrer et d’identifier correctement tous les constituants, surtout s’il s’agit de l’analyse d’un mélange complexe. Aussi y a-t-il des résultats contradictoires dus pour la plupart à des difficultés techniques ou d’interprétation, notamment en ce qui concerne l’identification certaine des constituants embryonnaires et adultes.

Dans l’étude présente, nous nous sommes adressé à une méthode nouvelle, la technique d’immuno-électrophorèse de Grabar & Williams (1953,1955) qui utilise à la fois la migration électrophorétique et la précipitation spécifique en milieu gélifié. Cette méthode permet donc de caractériser chaque constituant d’un mélange par une double définition, sa mobilité électrophorétique et ses propriétés immunochimiques.

Grâce à l’emploi de cette technique, nous avons pu suivre l’apparition progressive de quelques constituants caractéristiques de l’adulte dans le foie de l’embryon de Poulet.

Préparation des extraits d’organes

Les extraits utilisés dans cette étude proviennent d’organes prélevés sur des Poulets (adultes ou embryonnaires) de la race Leghorn blanc. Les foies prélevés ont été coupés en petits morceaux et lavés dans du liquide de Tyrode. Ensuite, ils ont été broyés dans un mortier avec du sable jusqu’à obtention d’une masse homogène. Le broyât a été repris dans du liquide de Tyrode à la température de 5°C. dans les proportions suivantes: 1 cm.3 de Tyrode pour 1 g. de tissu, pour le foie adulte; et 1 cm.3 de Tyrode pour 5 g. de tissu pour les extraits de foie embryonnaire.

Après centrifugation à 10.000 t.p.m. (environ 10.000 g.) pendant 15 à 20 minutes, l’extrait obtenu a été maintenu entre — 10 et — 15° C. jusqu’à utilisation.

Préparation de l’immunsérum

Pour préparer le sérum anti-foie adulte (SAF), nous avons injecté de l’extrait de foie de Poulet adulte à 6 lapins mâles âgés de 6 à 8 mois, au rythme de 2 à 3 injections par semaine. Chaque injection a été partagée en 2 cm.3 par voie intrapéritonéale et 1 ou 2 cm.3 par voie intraveineuse. Après 3 mois, nous avons prélevé 15 cm.3 de sang par ponction cardiaque. Les sérums des 6 lapins ont donné un ring-test positif avec l’extrait de foie adulte. Cependant 3 lapins seulement avaient produit un nombre satisfaisant d’anticorps. Le mélange de ces 3 sérums a été retenu pour faire quelques études préliminaires. Après un mois de repos, les 3 lapins sélectionnés ont reçu 7 nouvelles injections en 15 jours. Le sérum recueilli 10 jours après la dernière injection avait un pouvoir précipitant et un nombre d’anticorps nettement plus élevé. Les résultats exposés dans cette étude ont été obtenus avec le mélange de ces derniers sérums. Le détail de la progression de l’immunisation sera exposé dans un prochain travail.

Techniques utilisées

Double diffusion en plaques de gélose

Nous avons effectué quelques essais en utilisant la technique de double diffusion d’Ouchterlony (1948). L’antigène et l’immunsérum liquides sont versés dans des trous préparés dans une plaque de gélose; ainsi les deux réactifs diffusent librement dans le gel et, lorsqu’ils se rencontrent en proportions convenables, forment une ligne ou bande de précipité. Mais il arrive que les lignes de précipitation se superposent ou se dissocient, ce qui rend leur dénombrement et leur identification difficiles et souvent impossibles.

Immuno-électrophorèse

La méthode de Grabar & Williams (1953) consiste à effectuer une électrophorèse du mélange à étudier dans un gel de gélose. Lorsque la dispersion des constituants est jugée suffisante, on fait diffuser l’immunsérum perpendiculairement à l’axe de migration. Chaque constituant donnant une fine bande de précipité avec l’anticorps correspondant, on peut le définir par son emplacement sur l’axe de migration. Le nombre de lignes ainsi obtenues correspond au nombre minimum de constituants présents dans le mélange. Nous avons utilisé cette méthode dans les conditions expérimentales suivantes:

Les plaques sont maintenues en chambre humide à la température du laboratoire et le développement des lignes de précipitation suivi et surveillé pendant 5 jours.

Diffusion en milieu gélifié

En utilisant la méthode de double diffusion d’Ouchterlony, nous avons obtenu jusqu’à 5 zones de précipitation avec l’extrait de foie adulte. Leur dénombrement exact est cependant assez difficile; trois d’entre elles sont réellement nettes, les deux autres sont plutôt floues et semblent correspondre à la superposition de plusieurs lignes. Les trois systèmes principaux correspondent à un constituant à diffusion rapide (X), un constituant à diffusion lente (Y) et un constituant à diffusion moyenne (Z). Les lignes AT et K se forment avec l’extrait de foie adulte et les extraits de foie de poussin de 5 jours, d’embryons de 17,14 et 10 jours. La ligne Z correspond à un constituant qui apparaît vers le 16ème jour de la vie embryonnaire.

Immuno-électrophorèse

Avec le mélange de sérum anti-foie adulte choisi, nous avons obtenu jusqu’à 16 lignes de précipitation distinctes pour l’extrait de foie de Poulet adulte. La nomenclature que nous avons adoptée (Fig. 1) est basée sur l’emplacement des lignes de précipitation en partant du pôle positif ( + ) vers le pôle négatif ( – ) de l’axe de migration. Nous avons en outre tenu compte des positions relatives des lignes les unes par rapport aux autres.

Fig. 1.

Schéma et nomenclature des lignes de précipitation obtenues avec de l’extrait de foie adulte en présence de sérum anti-foie de Poulet adulte.

Fig. 1.

Schéma et nomenclature des lignes de précipitation obtenues avec de l’extrait de foie adulte en présence de sérum anti-foie de Poulet adulte.

Tableau 1.

Apparition progressive des constituants adultes pendant le développement embryonnaire

Apparition progressive des constituants adultes pendant le développement embryonnaire
Apparition progressive des constituants adultes pendant le développement embryonnaire

L’ordre d’apparition des différentes lignes est le suivant: tout d’abord se forment les lignes A, C, D, E, E’, G (pendant les 20 premières heures), puis apparaissent les lignes B, E”, F, H, I (pendant les 20 heures suivantes). Les autres apparaissent plus tardivement et assez irrégulièrement. Par leur position les 16 lignes de précipitation observées semblent toutes correspondre à des systèmes précipitants différents. En outre, elles finissent presque toutes par se croiser. La ligne F peut dans certains cas sembler correspondre à un dédoublement de la ligne G, mais, si on prolonge la durée de l’électrophorèse, elle peut être située au niveau de l’intersection des arcs E et G, ce qui montre bien qu’elle correspond elle aussi à un constituant distinct.

La distribution et le moment d’apparition des différents constituants pendant le développement sont résumés dans la Fig. 2 A, B. On voit que les constituants A, B, C, D, E et G sont déjà présents dans le foie de l’embryon de jours. Nous avons effectué deux expériences avec de l’extrait de foie d’embryons de 5 jours, et nous n’avons pu voir l’apparition que d’une seule ligne qui, par sa position, pourrait correspondre au constituant E. L’absence de réaction ne démontre pas l’absence des autres constituants. On peut penser plutôt qu’à ce stade leur concentration n’est pas suffisante pour former un précipité. Ne disposant que d’une quantité très minime de matériel à ce stade, nous n’avons pas pu concentrer l’extrait.

Fig. 2

A, B. Étude comparative des extraits de foie de Poulet adulte et embryonnaire à différents stades du développement. Les rectangles parallèles aux axes de migration électrophorétiques représentent les réservoirs dans lesquels a été versé le sérum anti-foie adulte. Les lignes de précipitation n’ont été figurées que d’un seul côté pour éviter de surcharger les schémas qui sont donnés en grandeur réelle.

(a) Foie de Poulet adulte: en présence de sérum anti-foie on obtient 16 lignes de précipitation distinctes. (Pour la nomenclature, voir Fig. 1.) La plupart de ces lignes se croisent, ce qui montre que les constituants correspondants n’ont aucune parenté immunologique.

(b) Foie de poussin de 5 jours: on observe 11 lignes. En dehors des arcs S et S′, il manque les arcs D′, D″ et E″.

(c) Foie d’embryons de 17-18 jours: on note la présence de 9 lignes. Il manque les arcs S, S′, C, D′, D″, E′ et E″.

(d) Foie d’embryons de 13-14 jours: il manque les arcs 5, S′, C′, D′, D″, E′, E″ et H.

(e) Foie d’embryons de 8-9 jours: on peut observer 7 lignes de précipitation qui correspondent aux constituants A, B, C, D, E, G et I.

(f) Foie d’embryons de612jours: sont présents les arcs A, B, C, D, E et G.

(g) Foie d’embryons de 5 jours: seul l’arc E est présent. L’absence de réaction des autres constituants n’indique pas forcément leur absence totale; ils peuvent être présents à des concentrations trop faibles pour réagir.

(h) Extrait de tronc d’embryons de 5 jours (noter la présence de l’arc A).

Fig. 2

A, B. Étude comparative des extraits de foie de Poulet adulte et embryonnaire à différents stades du développement. Les rectangles parallèles aux axes de migration électrophorétiques représentent les réservoirs dans lesquels a été versé le sérum anti-foie adulte. Les lignes de précipitation n’ont été figurées que d’un seul côté pour éviter de surcharger les schémas qui sont donnés en grandeur réelle.

(a) Foie de Poulet adulte: en présence de sérum anti-foie on obtient 16 lignes de précipitation distinctes. (Pour la nomenclature, voir Fig. 1.) La plupart de ces lignes se croisent, ce qui montre que les constituants correspondants n’ont aucune parenté immunologique.

(b) Foie de poussin de 5 jours: on observe 11 lignes. En dehors des arcs S et S′, il manque les arcs D′, D″ et E″.

(c) Foie d’embryons de 17-18 jours: on note la présence de 9 lignes. Il manque les arcs S, S′, C, D′, D″, E′ et E″.

(d) Foie d’embryons de 13-14 jours: il manque les arcs 5, S′, C′, D′, D″, E′, E″ et H.

(e) Foie d’embryons de 8-9 jours: on peut observer 7 lignes de précipitation qui correspondent aux constituants A, B, C, D, E, G et I.

(f) Foie d’embryons de612jours: sont présents les arcs A, B, C, D, E et G.

(g) Foie d’embryons de 5 jours: seul l’arc E est présent. L’absence de réaction des autres constituants n’indique pas forcément leur absence totale; ils peuvent être présents à des concentrations trop faibles pour réagir.

(h) Extrait de tronc d’embryons de 5 jours (noter la présence de l’arc A).

Notons qu’aucune réaction n’a pu être observée avec l’extrait de foie de Souris adulte ou embryonnaire. Les constituants correspondants aux lignes de précipitation observées, semblent donc être liés à l’espèce étudiée ou au moins à la classe des Oiseaux. De nouvelles expériences devront être faites avec des extraits d’organes de Canard, par exemple, pour préciser cette question.

A l’intérieur de l’espèce, nous avons observé de nombreuses réactions avec le sérum et d’autres extraits tels que l’extrait de cerveau, d’intestin, de peau, de mésonéphros, de métanéphros, de poumon et de cœur. Nous avons aussi noté des réactions avec les jus d’embryons de 5 jours et de 3 jours et avec le jaune d’œuf et le blanc d’œuf.

Dans ce travail, nous n’étudierons que les réactions obtenues avec le sérum de Poulet adulte (SP). Comme le montre la figure 3, le sérum de Poulet donne un certain nombre de lignes au contact du SAF. En absorbant le sérum anti-foie adulte par du sérum de Poulet adulte (SAF/SP), il ne réagit plus avec aucun constituant du SP, ni avec les constituants S-S’ et A du foie adulte. Tous les autres constituants du foie réagissent avec S AF ISP, ce qui montre qu’ils sont différents des constituants sériques. Dans toutes les expériences d’absorption, nous avons employé, comme témoin, du SAF auquel nous avions ajouté la même quantité de liquide physiologique qu’il était nécessaire d’ajouter de sérum de Poulet pour obtenir une absorption complète (SAF/T).

Fig. 3.

Schéma des lignes obtenues avec l’extrait de foie adulte (Fad) et le sérum de Poulet adulte (SP), en présence de sérum anti-foie adulte (SAF/T) et de sérum anti-foie absorbé par le sérum de Poulet (SAF/SP). On voit que SAF/SP ne réagit plus avec SP ni avec les constituants S-S’ et A du foie. L’absence de réaction du constituant H en présence de SAF/SP pose un problème particulier: soit que ce constituant est présent dans l’extrait de foie et dans le sérum, soit que dans l’antisérum absorbé les anti-corps anti-/Z sont en concentration trop faible pour réagir. En effet, avec un sérum anti-foie témoin auquel on a ajouté la même quantité de liquide de Tyrode qu’il était nécessaire d’ajouter de sérum de Poulet pour obtenir une absorption complète (SAF/T), le constituant H ne réagit pas.

Fig. 3.

Schéma des lignes obtenues avec l’extrait de foie adulte (Fad) et le sérum de Poulet adulte (SP), en présence de sérum anti-foie adulte (SAF/T) et de sérum anti-foie absorbé par le sérum de Poulet (SAF/SP). On voit que SAF/SP ne réagit plus avec SP ni avec les constituants S-S’ et A du foie. L’absence de réaction du constituant H en présence de SAF/SP pose un problème particulier: soit que ce constituant est présent dans l’extrait de foie et dans le sérum, soit que dans l’antisérum absorbé les anti-corps anti-/Z sont en concentration trop faible pour réagir. En effet, avec un sérum anti-foie témoin auquel on a ajouté la même quantité de liquide de Tyrode qu’il était nécessaire d’ajouter de sérum de Poulet pour obtenir une absorption complète (SAF/T), le constituant H ne réagit pas.

En dehors des constituants S et S’ qui paraissent être des constituants du sérum, l’absence de réaction du constituant A du foie avec le SAF/SP pose un problème particulier. En effet, le fait que la ligne A du foie se forme toujours à quelque distance du réservoir anticorps, alors que la ligne correspondante du sérum se forme toujours au contact direct de ce réservoir, suggère que les 2 molécules ne sont pas identiques, n’ayant pas le même coefficient de diffusion. Mais ce résultat pouvant être dû à une différence de concentration d’un même constituant dans les deux milieux, ne suffit pas pour établir une différence entre les deux molécules. Aussi de nouvelles recherches étaient-elles nécessaires pour préciser ce problème. Là encore, la méthode immuno-électrophorétique devait se révéler très fructueuse. Il est en effet possible, une fois l’électrophorèse terminée, de découper des cubes de gélose aux endroits où se trouvent les constituants que l’on se propose de comparer, et de les transporter au contact de l’immunsérum dans une autre plaque de gélose, en réalisant ainsi une expérience de double diffusion, suivant le schéma donné par Ouchterlony (1948). Ceci permet la comparaison directe de deux constituants séparés par l’électrophorèse. D’autre part, comme on se trouve en présence d’un seul ou d’un nombre très restreint de systèmes précipitants, le dénombrement des lignes est très aisé et l’étude de leur évolution largement facilitée. Ainsi, nous avons pu comparer les différents constituants du foie adulte et embryonnaire entre eux et avec ceux du sérum et d’autres extraits d’organes, pour lesquels nous avions observé des réactions croisées. Cette étude est en cours et fera l’objet d’une prochaine note. Disons simplement ici que les résultats préliminaires montrent une réaction d’identité complète entre le constituant A du foie et le constituant correspondant du sérum.

Par la même technique, nous avons comparé séparément les différents constituants du foie adulte avec leurs correspondants embryonnaires, et nous avons observé qu’ils donnent tous lieu à des réactions d’identité complète.

Il convient d’ajouter ici que dans certaines expériences d’immuno-électrophorèse, nous avons employé du sérum anti-foie adulte absorbé par un extrait de foie d’embryons de 9 jours (SAF/F9). Nous avons observé que ce sérum ne réagit plus avec aucun constituant des extraits de foie embryonnaires de 9 jours et de 7 jours. En présence d’extrait de foie embryonnaire de 13 jours il donne une seule ligne de précipitation qui, par son emplacement sur l’axe de migration, correspond au constituant F. Or on sait que, dans nos expériences, le constituant F est le seul qui différencie le foie embryonnaire de 13 jours du foie embryonnaire de 9 jours. De même en présence d’extrait de foie adulte, SAF/F9 ne réagit qu’avec les constituants qui différencient le foie adulte du foie embryonnaire de 9 jours, c’est-à-dire C′, D′, D″, E′, E″, F et les deux constituants sériques S et S’. Il faut noter que le constituant H ne réagit pas. Mais il en est de même dans toutes les expériences d’absorption (Fig. 3). Nous pensons que dans les sérums épuisés (SAF/F9; SAF/SP; SAF/T) les anticorps anti-H sont en concentration trop faible pour réagir. Ces résultats vérifient pleinement l’identité des constituants embryonnaires et adultes et confirment leur ordre d’apparition pendant le développement.

Toutes les réactions croisées n’ayant pas encore été étudiées, il est difficile de déterminer dans quelle mesure les différents constituants sont porteurs de la spécificité d’organe. Néanmoins, il semble que les lignes C′, D′, D″, E′, E″, F, H et I correspondent à des constituants spécifiques du foie, car elles ne se rencontrent nulle part ailleurs, du moins si l’on en juge par leur position sur l’axe de migration électrophorétique.

L’inventaire des substances caractéristiques de l’adulte chez l’embryon a déjà souvent été fait à l’aide des méthodes immunochimiques classiques. Mais il subsiste des doutes quant à l’identification certaine des constituants embryonnaires et adultes. En effet, la réaction d’une protéine embryonnaire avec un anticorps produit en réponse à l’administration d’une protéine de l’adulte, n’établit pas forcément l’identité des deux protéines. On comprend ainsi l’avantage que présente, dans ces études, la méthode d’immuno-électrophorèse de Grabar & Williams (1953). En dehors de la réaction de précipitation spécifique, elle permet de définir les différents constituants d’un mélange par une propriété physique, leur mobilité électrophorétique. Elle facilite d’autre part le dénombrement des lignes de précipitation et, dans tous les cas, elle permet de révéler un nombre plus grand de constituants que toutes les autres méthodes immunochimiques.

Grâce à cette méthode, nous avons pu démontrer l’existence d’au moins 14 constituants différents dans le foie du Poulet adulte. Parmi ces constituants, 11 sont présents dans le foie du Poussin de 5 jours, 9 dans le foie de l’embryon de 17 à 18 jours, 8 dans le foie de l’embryon de 13 à 14 jours, 7 dans le foie de l’embryon de 8 à 9 jours, et 6 à jours. Au 5ème jour, nous n’avons pu voir qu’une seule ligne qui semble correspondre au constituant E. L’absence, à ce stade, du constituant A dans le foie est surprenante, car ce constituant est présent dans l’extrait de tronc d’embryons de 5 jours. On peut penser que dans l’extrait de foie de 5 jours, sa concentration n’est pas suffisante pour donner lieu à la réaction de précipitation. Ne disposant que d’une quantité minime de matériel, nous n’avons pas pu concentrer l’extrait.

Cette étude montre que les substances de l’adulte apparaissent progressivement au cours du développement embryonnaire et qu’au moment de l’éclosion la structure chimique, principalement la structure protéique, caractéristique de l’adulte, est loin d’être réalisée. Ces résultats rejoignent les travaux de Kaminski & Durieux (1956) et de Scheidegger et al. (1956), qui ont montré que, chez l’Homme et le Poulet, le sang est encore incomplet aux premiers stades de la vie post-embryonnaire.

La méthode immuno-électrophorétique permet de démontrer l’existence d’au moins 14 constituants différents dans l’extrait de foie de Poulet adulte. Parmi ces constituants, 6 sont déjà présents chez l’embryon de jours. Les autres apparaissent progressivement au cours du développement. Il faut noter qu’au moment de l’éclosion, la structure chimique caractéristique de l’adulte est loin d’être réalisée. L’identité des constituants embryonnaires et adultes est basée sur les propriétés suivantes: (1) ils ont même mobilité électrophorétique et donnent une ligne de précipitation au même endroit sur l’axe de migration; (2) ils ont même coefficient de diffusion dans la gélose; (3) en plaques de double diffusion, ils donnent lieu à des réactions d’identité complète.

The immuno-electrophoretic method makes it possible to demonstrate at least 14 different constituents in extract of adult fowl-liver. Of these constituents, 6 are already present in the embryo. The others appear progressively during development. It is notable that at hatching the chemical structure of the adult is far from being realized. The identity of the embryonic and adult constituents is based on the following similarity of properties: (1) they have the same electrophoretic mobility and give a precipitation line at the same place on the migration axis; (2) they have the same diffusion coefficient in agar; (3) in double diffusion plates they give completely identical reactions.

Je remercie M. le Professeur P. Grabar de l’amabilité avec laquelle il m’a toujours accueilli dans son laboratoire et des nombreux conseils qu’il m’a donnés pendant la réalisation de ce travail.

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