Regional incorporation of 14CO2 into Amphibian gastrulae has been followed by autoradiography. Differences in uptake of the tracer in different parts appear already in the early gastrula. These differences only affect the cytoplasm while the nuclei, heavily labelled, show very similar radioactivities. In the late gastrula, however, the nuclei show the same gradients of activity as the cytoplasm.

De nombreux précurseurs radioactifs des protéines et des acides nucléiques ont été utilisés par divers auteurs afin de suivre le métabolisme au cours du développement embryonnaire des Batraciens. Les résultats intéressants qui ont été déjà obtenus par les méthodes biochimiques et par la technique autoradiographique engagent à poursuivre dans cette voie.

Friedberg & Eakin (1949), utilisant la glycine marquée au C14, ont remarqué la faible pénétrabilité pour cet acide aminé, à partir de la gastrula. Afin d’augmenter la vitesse d’incorporation, ils se sont vus obligés de travailler sur des fragments d’embryons. Afin d’éviter cet inconvénient et l’emploi de temps d’incubation assez longs — ce qui risque de diminuer la précision des résultats — deux auteurs ont utilisé le C14 sous forme de bicarbonate. C’est ainsi que Cohen (1954) a montré que le 14CO2 s’incorpore dans les acides nucléiques et les protéines, après être entré dans le cycle de Krebs. Un travail simultané de Flickinger (1954) a donné des résultats semblables; mais cet auteur s’est attaché, en outre, à l’étude de l’incorporation régionale et il a montré qu’il existe des différences marquées entre les différentes régions.

En ce qui concerne l’autoradiographie, signalons surtout les travaux de Ficq (1954), de Sirlin & Waddington (1954) et de Sirlin (1955). Ficq (1954), utilisant la technique des émulsions nucléaires, a analysé l’induction neurale en greffant des organisateurs marqués au préalable soit au glycocolle, soit à l’acide orotique. Elle a observé, entre autres, que l’activité est très nettement localisée dans les noyaux et que les régions de morphogenèse active sont celles qui se marquent le plus. Sirlin & Waddington (1954) et Sirlin (1955), utilisant la méthode de stripping de Doniach & Pelc (1950), ont suivi le sort de la glycine et de la méthionine dans des embryons de Triton. Ils ont également observé une activité nucléaire intense; pour ces auteurs, l’activité serait prédominante dans le mésoblaste. Notons toutefois, que tous ces résultats ont été obtenus après des temps d’incubation très longs, en raison de la lente incorporation de ces acides aminés.

C’est pourquoi nous avons utilisé le 14CO2 qui diffuse rapidement à travers la membrane vitelline et le coat des embryons; nous avons alors suivi, par autoradiographie, le sort de ce précurseur dans des gastrulas d’Axolotl, en examinant l’incorporation dans les différents territoires et en comparant les noyaux au cytoplasme.

Les œufs d’Axolotl obtenus par ponte spontanée étaient dégangués et lavés dans une solution saline ayant la composition suivante: NaCl, 350 mg.; KC1, 5 mg.; CaCl2, 10 mg.; H2O,1.000 c.c. 2 c.c. de la solution saline additionnée de bicarbonate radioactif (concentration finale 4 μc./c.c. soit 56 y/c.c.) étaient versés dans un pèse-filtre. Dix à vingt œufs étaient traités, dans un pèse-filtre, pendant une durée de 5 heures. Après ce laps de temps, les embryons étaient lavés et fixés à l’alcool-acétique à froid (acide acétique à 5 pour cent dans l’alcool absolu refroidi à - 8°) pendant 4 heures. Après un séjour de 12 heures dans de l’alcool absolu, également à - 8°, les œufs étaient placés dans du toluol préalablement refroidi; ils étaient enfin ramenés à la température ordinaire et enrobés dans la paraffine. Les coupes de 10 microns étaient déposées sur .des lames recouvertes au préalable d’un film de gélatine alunée, permettant l’application de l’émulsion. Certaines lames ont été traitées à la ribonucléase pendant 1 à 2 heures à 38° (conc. 0,4 à 1 mg. / c.c.) afin d’éliminer l’activité de l’ARN. Un autre lot de préparations a été soumis à l’action successive de la ribonucléase et de la désoxyribonucléase (2 heures dans une solution à 0,1 mg./c.c. de NaCl 9%o additionnée de Mg++ M/300). Après un lavage soigneux des lames hydro-lysées et séchage, l’émulsion nucléaire était appliquée suivant la technique décrite par Ficq (1955). Les durées d’exposition étaient de 5 jours. Après révélation et fixation, toujours suivant la technique de Ficq, les préparations ont été colorées au mélange vert de méthyl-pyronine pendant 10 minutes environ, lavées à l’eau courante et montées à la glycérine.

Voice les résultats obtenus pour l’incorporation totale du CO2:

Nous avons étudié quatre régions de jeune gastrula (cf. fig. 1). Le tableau 1 donne les résultats. C’est le neuroblaste qui présente la plus forte activité; l’ecto-blaste est un peu plus actif que le chordomésoblaste, tandis que l’entoblaste est très peu actif. D’une façon générale, l’activité est élevée dans les noyaux.

Tableau 1.

Résultats relatifs à la jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unité de surface des quatre territoires étudiés (cf. fig. 1)

Résultats relatifs à la jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unité de surface des quatre territoires étudiés (cf. fig. 1)
Résultats relatifs à la jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unité de surface des quatre territoires étudiés (cf. fig. 1)
Fig. 1.

Jeune gastrula. Territoires étudiés: A, neuroblaste présomptif; B, ectoblaste; C, région correspondant à l’organisateur; D, portion entoblastique.

Fig. 1.

Jeune gastrula. Territoires étudiés: A, neuroblaste présomptif; B, ectoblaste; C, région correspondant à l’organisateur; D, portion entoblastique.

Les territoires de la gastrula avancée où les traces ont été dénombrées sont indiqués sur la fig. 2. Les résultats sont résumés dans le tableau 2. L’activité se distribue de la même façon (A > B > C > D) que dans la gastrula jeune.

Tableau 2.

Résultats relatifs à la gastrula avancée. Nombre moyen de traces par unité de surface des quatre territoires étudiés (cf. fig. 2)

Résultats relatifs à la gastrula avancée. Nombre moyen de traces par unité de surface des quatre territoires étudiés (cf. fig. 2)
Résultats relatifs à la gastrula avancée. Nombre moyen de traces par unité de surface des quatre territoires étudiés (cf. fig. 2)
Fig. 2.

Gastrula avancée. Territoires étudiés: A, neuro-blaste; B, ectoblaste ventral; C, chordomésoblaste; D, portion entoblastique.

Fig. 2.

Gastrula avancée. Territoires étudiés: A, neuro-blaste; B, ectoblaste ventral; C, chordomésoblaste; D, portion entoblastique.

Enfin, nous avons déterminé l’activité par unité de surface pour le cytoplasme et le noyau. Les tableaux 3 et 4 résument les résultats obtenus aux deux stades étudiés. Nos observations montrent que, dès la jeune gastrula, des gradients d’activité sont très reconnaissables dans le cytoplasme, sans qu’il y ait de grandes différences pour les noyaux; au stade gastrula avancée par contre, les noyaux présentent des gradients d’activité très nets, parallèles à ceux qu’on trouve dans le cytoplasme aux deux stades étudiés.

Tableau 3.

Jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unité de surface

Jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unité de surface
Jeune gastrula. Nombre moyen de traces par unité de surface
Tableau 4.

Gastrula avancée. Nombre moyen de traces par unité de surface

Gastrula avancée. Nombre moyen de traces par unité de surface
Gastrula avancée. Nombre moyen de traces par unité de surface

En ce qui concerne la distribution de l’activité parmi les différentes substances marquées, nous ne pouvons faire état que de quelques résultats se rapportant à la gastrula moyenne (fig. 3). Trois embryons seulement ont été observés. Les tableaux 5 et 6 rendent compte de ces résultats.

Tableau 5.

Résultats relatifs à la gastrula moyenne

Résultats relatifs à la gastrula moyenne
Résultats relatifs à la gastrula moyenne
Tableau 6.

Distribution de la radioactivité parmi les différentes substances marquées

Distribution de la radioactivité parmi les différentes substances marquées
Distribution de la radioactivité parmi les différentes substances marquées
Fig. 3.

Gastrula moyenne. Territoires étudiés: A, neuro-blaste présomptif; B, ectoblaste; C, organisateur; D, enta-blaste.

Fig. 3.

Gastrula moyenne. Territoires étudiés: A, neuro-blaste présomptif; B, ectoblaste; C, organisateur; D, enta-blaste.

En ce qui concerne l’incorporation totale du 14CO2, nos observations autoradiographiques sont en bon accord avec les résultats de Flickinger (1954) qui a travaillé avec un compteur: il a observé des gradients d’activité, analogues à ceux que nous venons de décrire, tant en ce qui concerne les protéines que les acides nucléiques. Toutefois, nos premiers résultats n’indiquent de gradients que pour l’ARN au début de la gastrulation.

Ces gradients d’activité sont superposables aux gradients ribonucléiques, animal-végétatif et dorso-ventral, qui ont été observés cytochimiquement par Brachet (1944, 1952) et dont l’existence a été vérifiée par le dosage direct de l’ARN (Steinert, 1954; Takata, 1953).

Comme l’ont signalé Ficq (1954) et Sirlin (1955), la radioactivité est surtout concentrée dans les noyaux. Dès lors, il n’est pas étonnant de trouver une activité globale plus grande dans la partie animale, où les noyaux sont plus abondants. Mais l’examen de la distribution de l’activité cytoplasmique dans la jeune gastrula montre un parallélisme entre l’augmentation du nombre de traces et la diminution de la taille des plaquettes vitellines. Les différences métaboliques qui existent, au stade jeune gastrula, entre le neuroblaste et l’ectoblaste présomptifs étaient cependant inattendues: en effet, de nombreuses expériences (d’explantation, de transplantation, d’exogastrulation, etc.) ont montré que, en l’absence d’induction, ni la plaque médullaire présomptive, ni l’ectoderme présomptif d’une jeune gastrula ne sont capables de former du tissu nerveux.

Par contre, on peut mettre en évidence expérimentalement des différences entre le mésoblaste dorsal et ventral à ce stade. Nous savons toutefois par des expériences de Yamada (1950) et de Kawakami & Okano (1955) que la détermination est encore labile à ce moment. C’est à ce même stade que l’organisateur transforme l’ectoderme compétent en système nerveux, que différents agents chimiques peuvent provoquer la neuralisation, que la précytolyse, comme l’a montré Holtfreter (1947), suffit à provoquer la neuralisation spontanée de l’ecto-blaste.

Au moment où les territoires cytoplasmiques commencent à se différencier, dès la jeune gastrula, les noyaux présentent encore, en ce qui concerne l’incorporation du 14CO2, des radioactivités très voisines. Par contre, au stade gastrula avancée, les noyaux des divers territoires semblent s’être individualisés. Une pareille constatation concorde avec les résultats obtenus par Briggs et King qui ont transplanté des noyaux de jeune gastrula (Briggs & King, 1952) et de gastrula avancée (King & Briggs, 1955) dans des œufs vierges préalablement énucléés. Ils ont conclu de leurs expériences que les noyaux n’ont pas encore subi de changements irréversibles et qu’ils ont conservé toutes leurs potentialités dans la jeune gastrula et que c’est au cours de la gastrulation qu’ils se différencient. Il serait, croyons-nous, intéressant d’étendre ces résultats au cas des embryons dont le développement a été altéré expérimentalement (gastrulas centrifugées ou lithinées, hybrides létaux, etc.) afin de préciser la nature des échanges entre le noyau et le cytoplasme au cours de la morphogenèse.

L’incorporation du 14CO2 a été suivie, dans différents territoires de la gastrula d’Axolotl, par la méthode autoradiographique. Dès la jeune gastrula, on observe des gradients d’activité animal-végétatif et dorso-ventral. Ces différences affectent surtout le cytoplasme; les noyaux sont très actifs, mais ils présentent des radioactivités très voisines. On retrouve les mêmes différences au stade gastrula avancée. Mais à ce moment, les noyaux présentent des gradients d’activité parallèles à ceux qu’on trouve dans le cytoplasme.

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