Etude comparative de l’évolution des cellules de planaires d’eau douce Polycelis tenuis (lijima) dans des fragments dissociés en culture in vitro aspects ultrastructuraux, incorporations de leucine et d’uridine tritiée

Un problème majeur de la régénération réside dans l’identification des cellules de régénération et dans l’analyse de leurs potentialités. La contreverse subsiste chez les Planaires pour lesquelles deux conceptions s’opposent. Pour les uns (Lender, 1962; Wolff, 1962; Morita & Best, 1966; Bronsdted, 1969; Pedersen, 1972), indifférenciées appelées ‘néoblastes’ constituent un stock de cellules réparatrices qui interviennent dans la régénération physiologique et qui reconstituent les parties manquantes en cas de blessure. Pour les autres (Hay, 1968; Coward & Hay, 1972) des cellules déjà spécialisées perdent leurs structures différenciés et fournissent le matériel à partir duquel se reconstitueront les parties manquantes. Une des causes de cette controverse réside dans la difficulté parfois rencontrée pour distinguer en histologie photonique les cellules de type indifférencié et d’autres cellules également riches en ARN (Hay & Coward, 1975). Cela est dû notamment à la structure des tissus de Planaires, où les cellules et leurs prolongements présentent un enchevêtrement d’autant plus complexe que la substance interstitielle est très réduite. Un progrès dans la résolution de ce problème nous a paru possible en étudiant quelques aspects de l’évolution morphologique et biochimique des tissus de Planaires blessées, non plus sur des régénérais entiers mais sur des cellules séparées résultant de la dissociation et de la mise en culture de fragments. Notre milieu de culture adapté aux cellules de Planaires permet une survie de 12 à 14 jours (Franquinet, 1973a) améliorant les résultats déjà obtenus (Ansevin & Buchsbaum, 1961; Betchaku, 1967) sur des milieux liquides ou solides.

L’étude des mitoses, des synthèses d’ARN et de protéines déjà effectuée sur des régénérais entiers est reprise ici. L’observation des tissus dissociés confirme une différence fondamentale entre les cellules différenciées et les cellules indifférenciées, cette distinction s’appuie non seulement sur un examen photonique mais aussi sur une étude ultrastructurale. On sait par ailleurs que la différenciation des tissus d’un régénérât est sensible à divers agents, et notamment à l’action d’extraits de tissus homologues des parties à régénérer (revue dans Rose 1970). Chez les Planaires ces phénomènes ont été mis en évidence de façon particulièrement nette (Lender, 1954; Sengel, 1953). Nous avons entrepris l’étude in vitro de l’action de broyats de tissus sur l’évolution des cellules de régénération. Ces extraits ont été testés par leur action sur les mitoses, les synthèses d’ARN et de protéines. L’état des cellules est également contrôlé en microscopie électronique.

L’examen a porté sur des cellules différenciées ayant des structures caractéristiques bien connues telles que cellules sécrétrices à granulations acidophiles (Skaer, 1961; Pedersen, 1963) et musculaires (Sauzin-Monnot, 1968) qui, selon Hay & Coward (1975), par leur richesse en ARN pourraient être confondues avec les cellules à caractères indifférenciés. Nous avons également suivi l’évolution des cellules épidermiques (Klima, 1961).

D’autre part, en ce qui concerne les cellules indifférenciées, leur structure est décrite de façon constante dans l’animal intact (Pedersen, 1959; Morita & Best, 1966; Sauzin Monnot, 1967; Hay, 1968; Hay & Coward, 1975) et dans les tissus en régénération (Pedersen, 1959; Morita & Best, 1966; Sauzin-Monnot, 1967). En particulier pour suivre l’évolution de ces cellules nous avons recherché la présence des structures appellées émissions nucléaires (Morita & Best, 1966; Sauzin-Monnot, 1967) ou chromatoïd bodies (Hay, 1968 ; Hay & Coward, 1975). Ce critère est intéressant car il a été montré chez les jeunes que les émissions nucléaires volumineuses sont présentes dans toutes les cellules indifférenciées et qu’elles disparaissent lorsque les cellulles se différencient (Le Moigne, 1967).

Elles ne subsistent chez l’adulte que dans les néoblastes sous une forme discrète (Morita & Best, 1966; Sauzin-Monnot, 1967), et dans les spermatocytes (Franquinet, 1973b). Elles redeviennent abondantes dans les cellules indifférenciées dès le début de la régénération (Sauzin-Monnot, 1968; Morita, Best & Noël, 1969), ce caractère a été utilisé par Morita & Best (1974) pour suivre la différenciation des cellules de régénération in vivo.

Des régions prépharyngiennes de Polycelis tenuis adultes sont découpées en petits fragments de 1 à 2 mm de côté; elles sont rincées plusieurs fois dans un milieu stérile et mélangées pour obtenir une répartition homogène des cellules et des tissus provenant d’animaux différents. Les fragments sont cultivés dans une goutte de liquide déposé sur lamelle. Trois types de milieu sont utilisés: le milieu de base, le milieu de base avec des extraits de têtes ou des extraits totaux de tissus de Planaires. Ces extraits proviennent du surnageant de la centrifugation de broyats (5000 t/mn pendant 10 min); ces surnageants sont lyophylisés et ajoutés à raison de 0,5 g pour 10 ml de milieu.

La solution de base a la composition suivante: H₂O bidistillée, 1000 ml; NaCl, 0,7 g; KC1, 0,5 g; CaCl₂2H₂O, 0,4 g; MgSO₄7H₂O, 0,16 g; KH₂PO₄, 0,07 g; NaHCO₃, 0,17 g; hydrolysat de lactalbumine (Difco), 0,5 g; extrait de levure (Difco), 0,25 g; serum de cheval (Difco), 5 %; glucose, 20 g; péniciline, 1500 i.u./ml. Le pH de la solution est réajusté avec NaHCO₃ à 7,2–7,3. La température des cultures est de 18 °C.

Pour les examens histologiques, les cultures sont séchées à l’air, fixées dans le mélange de Carnoy et colorées au vert de méthyl-pyronine.

Les fragments et les cellules sont disposés sur des filtres Millipore pour permettre un transport aisé dans les différents bains de déshydratation et d’inclusion.

L’ensemble est fixé par le glutaraldéhyde à 2,5 % dans le tampon Sorënsen 0,05 M à pH 7,6 pendent 1 h à 4 °C, rincé puis post fixé à l’acide osmique à 1 % dans le même tampon, déshydraté dans l’alcool éthylique et inclus dans l’épon.

Les coupes sont faites au microtome ‘ultrotome’ L.K.B. 4800 équipé de couteau de verre, recueillies sur des grilles de cuivre recouvertes d’une membrane de collodion à 1 %, colorées par l’acétate d’uranyl-citrate de plomb (Reynolds, 1963). Les coupes sont observées avec un microscope Hitachi H.S. 7. ou avec un Jeol T. 7.

L’activité des synthèses est évaluée en fonction de l’âge de la culture et en fonction de la nature du milieu.

Les précurseurs radioactifs sont ajoutés au milieu de culture, 2 h avant la fixation, de telle sorte que la radioactivité finale soit de 20 μCi/ml pour l’uridine et la leucine. Après ces 2 h d’incubation les lamelles portant les cultures sont séchées à l’air, rincées pendant 30 min à l’eau courante, fixées dans le mélange de Carnoy 10 min, rincées 10 min dans de l’eau distillée et séchées à nouveau avant la pose de l’émulsion Ilford L. 4; la durée de contact est de 3 jours. Les lames sont colorées au vert de méthyl-pyrorine.

L’incorporation de la leucine tritiée est évaluée par comptage du nombre de grains d’argent par cellule, tandis que celle de l’uridine est mesurée à l’aide d’un cytophotomètre M.P.V. Leitz.

La technique de séchage des cultures fait que les taux de radioactivité observés sont ceux de cellules entières et non de fragments de cellules plus ou moins importants suivant le niveau d’une coupe histologique; ils sont donc comparables entre eux.

Chaque donnée quantitative résulte de l’examen de deux ou trois cultures dans chacune desquelles 100 cellules sont examinées. L’étude statistique de ces résultats a permis de calculer un intervalle de confiance, pour un coefficient de sécurité de 99 %, à partir des déviations standards des moyennes obtenues.

Le bruit de fond pour les précurseurs radioactifs a été évalué dans des surfaces équivalentes à la surface des cellules examinées; il est de 2,6 ± 0,2 grains d’argent par cellule pour la leucine et la déviation du cytophotomètre est de 7,6 ± 0,15 pour l’uridine. Les intervalles de confiance ainsi obtenus sont répartis sur les courbes d’incorporation de leucine, d’uridine et sur les courbes des taux mitotiques (Fig. 14).

Nous ne sommes pas parvenus à faire incorporer la thymidine ³H-5 aux cellules en culture. Ces espèces se montrent réfractaires à l’incorporation de ce précurseur (Best, Hand & Rosenvold, 1968; Gabriel, 1969; Coward, Hirsch & Taylor, 1970) aussi bien qu’à son analogue, la 5-bromodeoxy-uridine, qui, à des doses allant jusqu’à 1000 μg/ml n’affecte par le pouvoir de régénération (Le Moigne, non publié). Pour évaluer les synthèses d’ADN nous avons choisi d’étudier l’activité mitotique. Les mitoses sont comptées sur des cultures séchées et colorées au vert de méthyl-pyrorine. Chaque taux mitotique est obtenu à partir de 5000–15000 cellules comptées au hasard dans deux ou trois cultures faites dans les mêmes conditions. Les intervalles de confiance sont calculés pour un coefficient de sécurité de 95 % à partir des déviations standard des pourcentages obtenus. Le taux mitotique au moment de la mise en culture sert de témoin; il est de 0,7 ± 0,15 % et est identique au taux observé normalement chez les Polycelis adultes entières.

En culture les fragments se dissocient progressivement; vers 5 jours cette dissociation est presque complète sauf en ce qui concerne les cellules épidermiques. Ces cellules restent souvent associées entre elles, des lambeaux d’épiderme peuvent de détacher de la membrane basale, s’enrouler et former de petites masses arrondies tournoyant sur elles-mêmes dans les cultures. Ce cont, semble-t-il, ‘les corps de restitution’ (Freisling & Reisinger, 1958). Nous pouvons distinguer de façon satisfaisante les cellules différenciées et les cellules indifférenciées. Ces dernières sont de taille constante, arrondies, ou fusiformes (Fig. 1), avec un rapport nucléoplasmatique élevé, leur aspect cytologique varie peu pendant la durée de la culture (Fig. 2); elles se divisent (Fig. 3). Grâce aux dissociations cellulaires nous pouvons observer l’aspect des cellules différenciées qui sont de formes et de tailles variées, avec un cytoplasme abondant. Les cellules glandulaires, à rhabdites, ou intestinales sont aussi pyroninophile que les cellules indifférenciées mais le volume cytoplasmique et la présence fréquente d’inclusions exclut toute confusion. Le cytoplasme d’autres cellules différenciées tel que cellules musculaires, épider-miques, nerveuses n’est que très peu pyroninophile. Ces cellules ne se divisent pas.

Le taux mitotique des cellules différenciées est nul, nous n’en avons jamais observé en division.

Les cellules nerveuses et musculaires, à cytoplasme peu pyroninophile présentent un taux d’incorporation d’uridine très faible, et qui n’est pas significativement différent du bruit de fond. Les cellules glandulaires et intestinales sont marquées plus intensément et leurs radioactivités ont pu faire l’objet de mesures dont les résultats sont reportés sur le graphique 14d. Il apparait que cette radioactivité reste constante pendant toute la durée de la culture et est indépendante du type de milieu utilisé.

L’ultrastructure des cellules épidermiques ne varie que très peu au cours des cultures. L’altération cellulaire après 12 jours de culture est marquée par un arrondissement des noyaux. Dans le cytoplasme nous observons une augmentation du nombre de vésicules, les racines ciliaires sont conservées (Fig. 4).

Les cellules musculaires se détachent rapidement, nous pouvons observer dans leurs cytoplasmes les fibres du faisceau musculaire, un ergastoplasme avec des cisternes élargies, garnies d’un matériel fibrillaire caractéristique (Fig. 5). Ce type de cellules va très peu évoluer. Le 12ème jour les fibres des faisceaux musculaires ne sont pas désorganisées (Fig. 6). Il y a parfois au voisinage du noyau des formations fibrillaires assez denses évoquant les ‘émissions nucléaires’ des cellules indifférenciées (Fig. 5).

Les cellules à granulations acidophiles présentent des régressions cellulaires plus rapides. Ces cellules (Fig. 7) sont caractérisées par un ergastoplasme granulaire très développé avec des cisternes très larges et régulières contenant du matériel dense. Dans le cytoplasme les granulations de sécrétion acidophile montrent une striation régulière caractéristique (Skaer, 1961 ; Pedersen, 1963). Dès le 6ème jour (Fig. 8) alors que la cellule garde un aspect normal, les grains de sécrétion s’amenuisent, deviennent moins denses et perdent leurs striations. Au llème jour (Fig. 9) l’ergastoplasme a gardé son aspect caractéristique, son contenu est devenu plus clair. Les grains de sécrétion semblent se désagréger, le noyau présente des signes de picnoses.

Nous avons par ailleurs pu reconnaître après 10 jours de culture des cellules protonéphridiennes, des cellules nerveuses avec leurs axones, des spermatides, et différents types de cellules glandulaires. Leur ultrastructure reste stable puis évolue, plus ou moins rapidement, vers la picnose qui se manifeste au niveau nucléaire par des structures analogues à celles que nous montrons dans les cellules glandulaires (Fig. 9).

En résumé, la dissociation cellulaire et la mise en culture n’entrainent pas la division des cellules différenciées, ni un accroissement de leurs synthèses d’ARN. Le microscope électronique montre qu’elles conservent leurs structures caractéristiques, qu’elles ne se dédifférencient pas; ces cellules finissent par se nécroser après une période de culture qui est généralement plus longue que celle sur laquelle nous portons notre étude.

Ces cellules montrent des variations de leur taux mitotique en fonction de l’âge de la culture d’une par tet de la substance ajoutée dans le milieu d’autre part.

Dans le milieu de base, dès la mise en culture le taux mitotique augmente et reste élevé pendant 9 jours (Fig. 14a).

Les extraits de tête ont un effet inhibiteur qui devient sensible à partir du 5ème jour alors que les extraits totaux permettent d’observer une inhibition constante de l’activité mitotique.

La mise en culture dans le milieu de base stimule l’incorporation d’uridine qui atteint un maximum dès la 24ème heure.

Elle fléchit ensuite, progressivement avec une légère reprise vers le 7ème jour (Fig. 146). Avec l’adjonction d’extraits de Planaires on ne peut distinguer valablement les extraits de tête et les extraits totaux. En leurs présences les maxima d’incorporations sont retardés, les reprises du 6ème et 8ème jours plus marquées (Fig. 146).

L’incorporation de leucine (Fig. 14 c) est accrue dès la mise en culture en présence du milieu de base. Elle subit une inhibition dès le 3ème jour en présence d’extrait de tête (Fig. 14c). Avec les extraits totaux (Fig. 14 c) cette inhibition est immédiate. Dans tous les cas une reprise se manifeste entre 6 et 8 jours.

Ces extraits de Planaires sont connus pour leur effet inhibiteur sur la morphogenèse au cours de la régénération (Wolff, Lender & Ziller-Sengel, 1964). En culture des effets inhibiteurs analogues apparaissent sur les mitoses, et sur les synthèses des protéines avec des résultats différents suivant leurs origines. Il est évident que des extraits aussi peu purifiés entraînent des phénomènes complexes difficilement interprétables. Ces expériences devront être reprises en fractionnant et en purifiant les substances ajoutées aux cultures. Cependant un point semble intéressant à souligner présentement: à partir du 6ème jour de culture lorsque ces extraits inhibent les mitoses ils n’ont plus d’effets sur les incorporations de leucine et d’uridine.

Au moment de la mise en culture les cellules indifférenciées présentent l’aspect caractéristique déjà décrit (Pedersen, 1959; Morita & Best, 1966; Sauzin-Monnot, 1967): noyau volumineux, chromatine dispersée, nucléole finement granulaire, cytoplasme pauvre en organites (Fig. 10). Dès les premiers jours de culture apparaissent des émissions nucléaires (Figs. 10, 11). Au cours du déroulement des cultures nous pouvons observer le développement de structures qui apparaissent normalement dans les cellules indifférenciées au cours de la régénération: formation de polyribosomes (Figs. 10, 11) développement des émissions nucléaires (Fig. 11) qui subsistent jusqu’à la fin des cultures (Fig. 13). D’autre part il apparaît rapidement dans le cytoplasme un réticulum endoplasmique sous forme de cisternes alignées parallèlement au noyau (Figs. 11, 12), des formations golgiennes sont observables le plus souvent à la fin de la période de culture (Fig. 12). Les noyaux conservent une structure saine: chromatine relativement dispersée, granules interchromatiniens abondants. Les nucléoles, chaque fois que nous avons pu les observer, présentent une structure normale. Après 12 jours de culture des signes de picnose se manifestent progressivement comme pour toutes les cellules.

Au cours de cette étude ultrastructurale nous avons remarqué que les cellules indifférenciées cultivées dans le milieu de base avaient un réticulum endoplasmique qui apparaissait plus tardivement, vers 10 jours environ, que dans les cellules cultivées en présence d’extraits de Planaires (apparition vers 6 jours).

L’effet de la mise en culture sur les cellules indifférenciées est toujours de stimuler les mitoses et d’accroître le taux de synthèses d’ARN et de protéines. Ces effets sont modulés par la nature des substances ajoutées au milieu de culture.

D’autre part dans l’état actuel des observations morphologiques nous pouvons dire que la poursuite de synthèses élevées d’ARN et de protéines liées à un taux mitotique intense (milieu de base) correspondent à des cultures dans lesquelles les cellules indifférenciées ne forment que tardivement un réticulum endoplasmique. Par contre dans des cultures en présence d’extraits de Planaires le taux élevé de synthèses d’ARN et de protéines lié à une baisse marquée des taux mitotiques peut être mis en relation avec une apparition plus précose d’un réticulum endoplasmique.

L’intérêt des cultures de fragments dissociés de Planaire est de comparer l’évolution des cellules différenciées et indifférenciées isolées de l’organisme et donc soustraites à des influences inductrices éventuelles. Ces deux catégories de cellules se comportent différemment: ces résultats présentent un intérêt majeur du fait de la controverse toujours vive sur l’origine des cellules de régénération.

En ce qui concerne les cellules différenciées, dans les 12 jours de culture nous constatons que ces cellules ne se divisent pas, conservent le même rythme d’activité de synthèse qu’au début des cultures.

Ces cellules ne présentent aucun des signes d’activation que l’on pourrait s’attendre à rencontrer normalement dans des cellules destinées, après blessure à se dédifférencier et reformer de nouveaux tissus.

Dans les cellules différenciées, Hay (1968) signale des structures analogues aux ‘émissions nucléaires’ (corps chromatoïdes), nous avons également observé ce type de structure au voisinage des noyaux dans quelques cellules différenciées, elles sont présentes au début de la période de culture et disparaissent assez tôt. On peut se demander si elles ne caractérisent pas des cellules qui achèvent leur différenciation à la fin d’un processus de régénération physiologique déjà entamé avant la mise en culture.

Les cellules indifférenciées sont activées et acquièrent au cours de leur évolution des caractères identiques à ceux observés dans les néoblastes en différenciation (Pedersen, 1959; Morita & Best, 1966; Sauzin-Monnot, 1967) ou dans les blastomères d’un embryon au cours de l’embryogenèse (Le Moigne, 1967). Ces cellules se divisent, incorporent activement la leucine et l’uridine et sont sensibles à des facteurs connus pour leur pouvoir inhibiteur de la morphogenèse, elles esquissent une différenciation in vitro marquée par l’apparition d’un réticulum endoplasmique faiblement granulaire puis d’un appareil de Golgi.

Ces cellules semblent capables de réagir, de répondre à des modifications de milieu, et présentent un comportement compatible avec le rôle qu’elles ont pour certains auteurs dans la régénération des Planaires adultes.

L’étude des cellules de Planaires issues de fragments dissociés cultivés in vitro permet de suivre l’évolution de deux groupes de cellules:

1. Les cellules différenciées, qui ne se divisent pas, ne se dédifférencient pas. Leurs taux d’incorporation de leucine et d’uridine restent stable pendant toute la durée de la culture.

2. Les cellules indifférenciées, qui réagissent à la mise en culture par des variations des taux mitotiques et d’incorporation de leucine et d’uridine. Après 10 jours de culture elles présentent des caractères de cellule en différenciation.

Ces résultats sont en accord avec ceux des auteurs qui attribuent aux cellules indifférenciées le rôle essentiel au cours de la régénération des Planaires adultes.

Je remercie Monsieur le Professeur Meyer de l’Unité 7 de 1TNSERM qui m’a permis de réaliser une partie le l’étude ultrastructurale dans son laboratoire, ainsi que Madame Osborne-Pellegrin.