ABSTRACT
Reversibility of the morphological and functional dedifferentiation occurring in cultures of avian embryonic liver cells
Primary cell cultures are established from 8-day quail embryo livers. During the first three days the culture is made up of areas of epithelial-like cells and scattered fibroblasts. The cytoplasm of the epithelial cells shows a high glycogen content as detected by the PAS reaction controlled with salivary amylase digestion. During the following days an important increase in the number of fibroblastic cells is observed. After 6–7 days of cultivation, the epithelial cells have disappeared and the culture is entirely fibroblastic. PAS technique does not show any trace of glycogen in these cultures which have been prolonged up to 45 days.
Six-to 45-day primary cultures entirely made up of fibroblasts were associated with hepatic or pulmonary mesenchyme in organotypic culture for 3–4 days. In some cases the explant was first cultivated in vitro for 2 days and then grafted into a 5-day-old chick embryo on the chorioallantoic membrane for 6 days. In the secondary cultures hepatocytes showing an epithelial arrangement and a high glycogen content were observed.
It appears from this observation that some of the primary culture fibroblasts are in fact dedifferentiated parenchymal cells. Such a dedifferentiation is a reversible phenomenon since the cells retain the ability to express their initial determination if they are placed in convenient environmental conditions. The role of the specific tissular arrangement in the stability of the differentiated state is discussed.
INTRODUCTION
De nombreux auteurs ont tenté d’établir des lignées cellulaires à partir de cultures de tissu hépatique d’oiseaux et de mammifères. Les cellules du foie de mammifère peuvent être cultivées pendant de longues périodes et des cultures clonales ont même pu être obtenues à partir de foie de rat nouveau né (Coon, 1969; Lambiotte, Susor & Cahn, 1972; Chessebeuf et al. 1974); de foie de souris (Evans et al. 1952; Waymouth, Chen & Wood, 1971); de foie humain foetal ou adulte (Chang, 1954) et de foie de veau (Pieck & Kuyper, 1961).
Le but des recherches effectuées dans ce domaine était d’établir des cultures massives de cellules hépatiques métaboliquement actives. Le plus souvent les cultures de foie de mammifère sont constituées de cellules présentant un aspect épithélial. Cependant, bien que dans certains cas il ait été possible de déceler dans les cellules certaines propriétés des hépatocytes (production de protéines sériques - Coon, 1969; Namba, Hirox & Kishimoto, 1968; Kaighn & Prince, 1971; Waymouth et al. 1971; Bissell & Tilles, 1971; présence de glycogène - Gerschenson, Andersson & Molson, 1970; existence de la forme B de l’aldolase - Chessebeuf et al. 1974), le plus généralement les caractéristiques biochimiques et fonctionnelles du tissu hépatique disparaissent rapidement en culture (Evans et al. 1952; Perske, Parks & Walker, 1957; Auerbach & Walker, 1959; Hillis & Bang, 1962; Watanabe, 1966; Fogel, 1968; Rose, Kumegawa & Cattoni, 1968; Alexander & Grisham, 1970; Lambiotte et al. 1972).
L’explantation de foie embryonnaire de poulet n’a donné lieu qu’à des cultures de durée limitée ne supportant pas de repiquages successifs (Kuroda & Nagatani, 1965; Angulo, 1968; Laschi & Rizzoli, 1968; Verne & Hébert, 1968; Skea & Nemeth, 1969; Lambiotte, 1970; Verne, Hébert, Richshoffer & Roux,1971). Elles sont constituées au cours des premiers jours, de plages épithéliales et de cellules d’aspect fibroblastique qui deviennent rapidement prédominantes. Après quelques jours, les plages épithéliales disparaissent et les fibroblastes sont alors le seul type cellulaire de la culture.
Il apparaît donc que les conditions de la culture cellulaire sont défavorables au maintien de l’activité fonctionnelle de la cellule hépatique. Nous nous sommes posé la question de savoir si les fibroblastes résultant de l’explantation prolongée du foie d’oiseau dérivaient exclusivement des cellules endothéliales et conjonctives du tissu hépatique ou si certains d’entre eux pouvaient provenir de cellules parenchymateuses morphologiquement et physiologiquement dédifférenciées. Dans ce dernier cas il était intéressant de rechercher si la dédifférenciation imposée par les conditions de la culture était ou non réversible.
Dans des recherches précédentes de notre groupe le rôle de la composante mésodermique du foie sur la différenciation de l’endoderme en hépatocytes et sur le maintien de l’activité fonctionnelle de ces cellules a été démontré (Le Douarin, 1964; Le Douarin & Houssaint, 1967; Le Douarin, 1968; Houssaint, 1972) De plus il a été établi que l’ensemble du mésoderme des lames latérales peut jouer le même rôle que le mésenchyme propre du foie sur la différenciation des cellules endodermiques en parenchyme hépatique (Le Douarin, Bussonnet & Chaumont, 1968).
Dans le présent travail nous avons étudié l’évolution morphologique et le contenu en glycogène des cellules hépatiques d’embryons de caille de 8 jours dissociées par action de la trypsine puis transplantées en milieu liquide. Le temps de culture maximum a été de 45 jours. Lorsque les cultures ont atteint un état fibroblastique homogène nous les avons associées en culture organotypique avec du mésenchyme d’origine splanchnique et nous avons pu montrer que des cellules hépatiques fonctionnelles dérivant de la culture primaire apparaissent dans les expiants.
MATERIEL ET METHODES
(a) Cultures primaires de cellules hépatiques
Les cultures cellulaires sont réalisées à partir de foies d’embryons de caille de 8 jours. Les organes prélevés stérilement sont découpés en minces fragments dans du liquide de Tyrode puis incubés à 37 °C, pendant 30 min, dans une solution de trypsine (NBC) à 0,25% dans du liquide de Tyrode sans Ca ni Mg. Au cours de cette incubation, la solution est agitée à trois reprises par pipetages répétés. Après filtration sur gaze, les cellules isolées ainsi que les petits agrégats cellulaires sont lavés deux fois dans du milieu de Eagle additionné de 20°/0 de sérum fœtal de veau. Les cellules sont alors mises en culture dans des boîtes de Pétri Falcon de 35 mm de diamètre, à raison de 106 cellules par ml de milieu. On place le plus souvent une lamelle de verre dans le fond du récipient de culture. Nous avons également réalisé des cultures dans des boîtes dont le fond est recouvert d’un film de collagène. Nous utilisons le milieu MEM de Eagle (Wellcome) additionné de 10% de sérum fœtal de veau. De la pénicilline (100 unités/ml) et de la streptomycine (100 μg/ml) sont ajoutées au milieu. Les cultures sont incubées en atmosphère humide dans une étuve Nacional à circulation gazeuse (95% air-5% CO2) et le milieu de culture est renouvelé tous les trois jours. Les cultures sont observées avec un microscope à contraste de phase Wild M40.
(b) Obtention des mésenchymes hépatique et pulmonaire
Mésenchyme hépatique
La technique qui permet d’obtenir du mésenchyme hépatique à l’état pur a été mise au point par Le Douarin (1964). On peut isoler la partie postérieure de l’aire présomptive du mésenchyme hépatique en empêchant expérimentalement la progression des cellules endodermiques dans ce territoire. Pour cela, on excise un fragment de l’aire latérale au niveau des somites antérieurs, au-dessous du niveau de la lèvre antérieure de l’ombilic intestinal, chez des embryons de 6 à 13 somites (Fig. 1 A). La progression caudale des cordons endodermiques est arrêtée par l’opération. En arrière du territoire excisé, du mésenchyme hépatique se développe; il est prélevé du 6ème au 9ème jour de l’incubation. Le mésenchyme hépatique ainsi obtenu est dans tous les cas totalement dépourvu d’hépatocytes (Fig. 1 B). Ceci a été éprouvé au cours de nombreuses expériences réalisées avec le mésenchyme propre du foie isolé expérimentalement (Le Douarin, 1964; Houssaint & Le Douarin, 1971; Houssaint, 1972) (Fig. 1A, B).
(A) Isolement du mesenchyme hépatique (mh). On excise un fragment de Faire latérale (ex) au niveau des somites antérieurs.f: région où le foie se différencie normalement. (D’après Le Douarin, 1964.) (B) Mésenchyme hépatique prélevé sur un embryon de poulet de μneq] jours. Les travées mésenchymateuses (tm) sont dépourvues d’hépatocytes. Hématoxyline-éosine. × 315.
(A) Isolement du mesenchyme hépatique (mh). On excise un fragment de Faire latérale (ex) au niveau des somites antérieurs.f: région où le foie se différencie normalement. (D’après Le Douarin, 1964.) (B) Mésenchyme hépatique prélevé sur un embryon de poulet de μneq] jours. Les travées mésenchymateuses (tm) sont dépourvues d’hépatocytes. Hématoxyline-éosine. × 315.
Mésenchyme pulmonaire
On prélève les ébauches pulmonaires sur des embryons de poulet de 4 jours. La séparation du mésenchyme et de la bronche est obtenue par action d’une solution de trypsine à 1% dans du liquide de Tyrode sans Ca ni Mg selon une technique décrite par Dameron (1961). Le mésenchyme est rincé dans du Tyrode normal additionné de 10% de sérum de poulain pour épuiser la trypsine avant la mise en culture.
(c) Cultures secondaires
Dans une première série expérimentale, les cellules hépatiques cultivées pendant 6 à 45 jours sont décollées de la lamelle de verre, à laquelle elles adhèrent, à l’aide d’une spatule puis elles sont retransplantées soit sur un milieu semi-solide (Wolff & Haffen, 1952) soit sur un filtre millipore posé sur une grille de type Trowell. Dans ce dernier cas, le milieu a la même composition que celui que nous utilisons pour les cultures primaires de cellules hépatiques (milieu MEM de Eagle +10% de sérum fœtal de veau). L’explant est cultivé pendant 3 à 4 jours dans ces conditions puis fixé pour l’examen histologique.
Dans une deuxième série expérimentale, nous avons réalisé des associations de cultures primaires avec le mésenchyme hépatique ou pulmonaire. La culture primaire que l’on a laissé évoluer pendant 6 à 45 jours, est alors placée en culture organotypique au contact d’un mésenchyme hépatique ou pulmonaire. Cette association est réalisée sur un milieu de Wolff et Haffen ou sur un filtre millipore reposant sur une grille de type Trowell. L’explant est cultivé pendant 3 à 4 jours puis fixé par le liquide de Gendre. Dans certaines séries expérimentales, l’explant est cultivé 1 ou 2 jours puis retransplanté in ovo pendant 6 jours dans le cœlome d’un embryon de poulet de 3 jours d’incubation ou sur la membrane chorioallantoïdienne (CAM) d’un embryon de 6 jours (Fig. 2).
Réalisation de cultures secondaires par association de cultures primaires de 6 à 45 jours avec du mésenchyme hépatique. L’association est réalisée in vitro pendant 3 à 4 jours. Dans certains cas elle est prolongée en greffe in ovo pendant 6 jours.
(d) Détection du glycogène
Les lamelles portant les cultures cellulaires, ainsi que les expiants résultant de la combinaison des cultures primaires et du mésenchyme hépatique ou pulmonaire sont fixés par le liquide de Gendre à – 20 °C pendant 10 min, puis 20 min à 4 °C. La déshydratation est également effectuée à 4 °C. Des résultats antérieurs ont en effet montré que la fixation par le liquide de Gendre pratiquée à basse température et très rapidement, permet de préserver de très petites quantités de glycogène (Houssaint et Le Douarin, 1974). Les tissus sont ensuite soumis à la réaction à l’acide périodique Schiff (APS) selon la méthode de Hotchkiss-MacManus (1948), en vue de la détection du glycogène, puis post colorés par l’hématoxyline de Groat.
RESULTATS
T Evolution des cultures primaires d’hépatocytes
Observation au microscope à contraste de phase
Quelques heures après leur mise en culture, les cellules adhèrent à la lamelle de verre placée au fond de la boîte de Pétri. Dans les cultures de 12 h on observe de petites plages épithéliales constituées de 8 à 10 cellules arrondies pourvues d’un gros nucléole. Entre ces plages sont dispersées quelques volumineuses cellules isolées d’aspect fibroblastique possédant un noyau hypertrophié. Ces cellules se multiplient rapidement et après 48 heures les plages épithéliales sont beaucoup plus larges tandis que les cellules fibroblastiques deviennent beaucoup plus nombreuses (Fig. 3 A).
(A)Culture de 48 h observée au microscope à contraste de phase. Quelques volumineux fibroblastes (f) sont observés au bord des plages épithéliales (c.ep). x 540.
(B). Culture de 48 h traitée par la réaction à l’APS. Certaines cellules épithéliales (f) sont riches en glycogène, d’autres en sont déjà dépourvues. La réaction est négative au niveau des fibroblastes (/). APS-hématoxyline. x 125.
FIGURES 3 ET 4 Cultures primaires réalisées à partir de foies d’embryon de caille de 8 jours.
(A)Culture de 48 h observée au microscope à contraste de phase. Quelques volumineux fibroblastes (f) sont observés au bord des plages épithéliales (c.ep). x 540.
(B). Culture de 48 h traitée par la réaction à l’APS. Certaines cellules épithéliales (f) sont riches en glycogène, d’autres en sont déjà dépourvues. La réaction est négative au niveau des fibroblastes (/). APS-hématoxyline. x 125.
FIGURES 3 ET 4 Cultures primaires réalisées à partir de foies d’embryon de caille de 8 jours.
A partir du 4 ème jour, les cellules de type fibroblastique prennent de plus en plus d’importance par rapport aux cellules épithéliales. Après 96 h, la culture forme une couche continue constituée en majorité de fibroblastes. On reconnaît encore à ce stade quelques grandes plages de cellules épithéliales dont le cytoplasme apparaît chargé de vacuoles. Au bord des plages épithéliales on observe des cellules d’aspect intermédiaire à noyau ovale qui semblent s’échapper. Les cellules continuent à se multiplier activement formant même plusieurs couches superposées dans certaines zones. Après 6 à 7 jours les cellules épithéliales ne sont pratiquement plus décelables et la culture revêt un aspect uniquement fibroblastique (Fig. 4A) qu’elle gardera par la suite. Les cultures réalisées sur substrat de collagène montrent la même évolution. Certaines cultures ont été prolongées jusqu’à 45 jours. Des essais de repiquage, par dissociation de la culture primaire sous l’action de la trypsine, se sont soldés par un échec.
(A)Culture primaire de 6 jours observée au contraste de phase. Toutes les cellules ont un aspect fibroblastique, x 540.
(B). Culture primaire de 6 jours traitée par la réaction à l’APS. La réaction est négative. Le cytoplasme des fibroblastes contient seulement des mucopolysaccharides qui ne disparaissent pas après action de l’amylase salivaire. APS-hématoxyline. x315.
(A)Culture primaire de 6 jours observée au contraste de phase. Toutes les cellules ont un aspect fibroblastique, x 540.
(B). Culture primaire de 6 jours traitée par la réaction à l’APS. La réaction est négative. Le cytoplasme des fibroblastes contient seulement des mucopolysaccharides qui ne disparaissent pas après action de l’amylase salivaire. APS-hématoxyline. x315.
L’évolution des cultures de cellules hépatiques d’embryons de caille permet donc d’observer une disparition progressive des cellules épithéliales tandis que les fibroblastes deviennent les éléments dominants puis exclusifs de la culture.
Détection du glycogène dans les cultures d’hépatocytes
La réaction à l’APS appliquée aux cultures de 24 et 48 h est fortement positive au niveau des plages épithéliales (Fig. 3 B) et le contrôle à l’amylase salivaire montre que le polysaccharide présent dans les cellules est du glycogène. Après 3 jours de culture, seules quelques unes des cellules épithéliales constituant les plages sont APS positives et après 4 jours on n’observe plus aucune trace de glycogène. Dans les cultures plus âgées, le réactif de Schiff permet de mettre en évidence des polysaccharides résistants à l’action de l’amylase salivaire (Fig. 4B).
II Réalisation de cultures secondaires
Dans une première étape, nous laissons évoluer des cultures histiotypiques pendant 6 à 45 jours, puis le film cellulaire détaché à l’aide d’une spatule est placé en culture organotypique sur un milieu de Wolff et Haffen ou sur un filtre supporté par une grille de type Trowell. Au bout de 3 jours de culture l’observation histologique des expiants, après fixation par le liquide de Gendre et traitement par la réaction à l’APS, montre que les cellules dégénèrent rapidement. Elles apparaissent dispersées dans une substance fondamentale riche en polysaccharides. Aucune structure de type hépatique n’est reconstituée dans ce cas et les cellules ne possèdent aucune des caractéristiques des cellules parenchymateuses. En particulier elles ont un noyau de petite taille et sont totalement dépourvues de glycogène.
Dans un deuxième temps, nous avons associé des cultures cellulaires primaires de 6 à 45 jours au mésenchyme hépatique ou pulmonaire.
Lorsque la culture primaire est associée au mésenchyme hépatique après 6 à 22 jours de culture, l’examen histologique des expiants ou des greffons permet d’observer que des hépatocytes sont présents au sein du mésenchyme hépatique. Ils sont caractérisés par une structure de type épithélial et un noyau contenant un nucléole particulièrement volumineux comme c’est le cas dans les cellules parenchymateuses de foie de caille normal. Il est possible en effet de reconnaître les cellules de caille des cellules de poulet après une simple coloration du noyau par l’hématoxyline de Groat (Le Douarin, 1969, 1973). De plus, la réaction à F APS montre que leur cytoplasme est très riche en glycogène (Fig. 5 A à D). Lorsque l’association est réalisée in vitro, le tissu hépatique forme le plus souvent un ou deux îlots compacts au voisinage desquels on observe des cellules qui possèdent un noyau de petite taille et qui sont dépourvues de glycogène. Lorsque l’association est prolongée en greffe in ovo, le tissu hépatique qui se reconstitue a une structure proche de celle du foie normal. 11 est alors formé de cordons d’hépatocytes séparés par des sinusoïdes sanguins (Fig. 5D). Des résultats similaires ont été obtenus dans les associations de mésenchyme pulmonaire avec des cultures primaires de foie de 6 à 22 jours (Tableau 1).
Récupération de la capacité de synthétiser du glycogène par des cultures primaires de foies d′embryons de caille de 8 jours associées au mésenchyme hépatique ou pulmonaire d′embryons de poulet

Cultures secondaires: association de cultures primaires avec du mésenchyme hépatique d’embryon de Poulet. On observe au sein du mésenchyme des cellules hépatiques (ch) riches en glycogène (g).
(A). Culture primaire de 6 jours. Durée de la culture secondaire: 3 jours en culture in vitro. APS-hématoxyline. x 900.
(B). Culture primaire de 10 jours associée au mésenchyme hépatique pendant 3 jours en culture in vitro. APS-hématoxyline. x 1100.
(C). Culture primaire de 12 jours associée au mésenchyme hépatique pendant 4 jours en culture in vitro. Les cellules hépatiques possèdent le volumineux nucléole caractéristique des cellules de caille (flèches) et elles sont riches en glycogène (g). APS-hématoxyline. xll50.
(D). Culture primaire de 18 jours associée avec du mésenchyme hépatique pendant 24 h en culture in vitro puis pendant 6 jours en greffe dans le coelome d’un embryon de poulet de 3 jours. Les cellules hépatiques sont organisées en cordons (ch) séparés par des sinusoïdes sanguins (w). APS-hématoxyline. x 600.
Cultures secondaires: association de cultures primaires avec du mésenchyme hépatique d’embryon de Poulet. On observe au sein du mésenchyme des cellules hépatiques (ch) riches en glycogène (g).
(A). Culture primaire de 6 jours. Durée de la culture secondaire: 3 jours en culture in vitro. APS-hématoxyline. x 900.
(B). Culture primaire de 10 jours associée au mésenchyme hépatique pendant 3 jours en culture in vitro. APS-hématoxyline. x 1100.
(C). Culture primaire de 12 jours associée au mésenchyme hépatique pendant 4 jours en culture in vitro. Les cellules hépatiques possèdent le volumineux nucléole caractéristique des cellules de caille (flèches) et elles sont riches en glycogène (g). APS-hématoxyline. xll50.
(D). Culture primaire de 18 jours associée avec du mésenchyme hépatique pendant 24 h en culture in vitro puis pendant 6 jours en greffe dans le coelome d’un embryon de poulet de 3 jours. Les cellules hépatiques sont organisées en cordons (ch) séparés par des sinusoïdes sanguins (w). APS-hématoxyline. x 600.
Lorsque la culture primaire a été prolongée entre 22 et 45 jours, aucune cellule hépatique n’a été observée dans les cultures secondaires quel que soit le type d’association réalisée (Tableau 1).
CONCLUSION ET DISCUSSION
Lorsque du tissu hépatique différencié d’embryons de caille de 8 jours est cultivé in vitro les cellules subissent des transformations morphologiques et physiologiques profondes. Des plages de cellules d’aspect épithélial subsistent quelques jours puis font place à des cellules fibroblastiques qui deviennent après 6 jours le seul constituant de la culture. Simultanément, les cellules se modifient du point de vue physiologique et le glycogène décelable dans les plages épithéliales disparaît totalement à partir du 4ème jour de culture.
La perte des fonctions et des caractéristiques structurales des constituants cellulaires du foie en culture in vitro a été très généralement constatée par divers auteurs quelle que soit l’espèce utilisée. Sauf dans quelques cas particuliers tels que les cultures de foie humain établies par Kaighn & Prince (1971) dans lesquelles on a pu mettre en évidence la synthèse d’une molécule antigéniquement semblable à la sérum albumine, les cellules d’aspect fibroblastique ne présentent pas les propriétés biochimiques caractéristiques des hépatocytes. La ‘transformation’ fibroblastique des cellules de foie en culture pose le problème d’une dédifférenciation morphologique et fonctionnelle possible des éléments parenchymateux. On peut concevoir en effet que dans le cas du foie d’oiseau les fibroblastes dérivent non seulement des cellules mésenchymateuses mais correspondent aussi à des hépatocytes apparemment dédifférenciés.
Cette conception s’est révélée exacte. En effet, si une culture primaire de foie purement fibroblastique est associée à du mésenchyme splanchnique d’origine hépatique ou pulmonaire, elle fournit des groupes de cellules parenchymateuses riches en glycogène.
L’association interspécifique d’une culture primaire de foie de caille avec du mésenchyme hépatique de poulet permet de se rendre compte que les cellules parenchymateuses dérivent de la culture fibroblastique primaire de caille. Les propriétés du noyau chez la caille permettent en effet de reconnaître les cellules de cette espèce de celles du poulet (Le Douarin, 1969, 1973).
Dans les cultures secondaires obtenues par l’association des ‘fibroblastes’ avec le mésenchyme splanchnique, on constate que les cellules contenant du glycogène sont organisées en un épithélium et sont en contact avec les éléments mésenchymateaux. Ainsi, l’architecture tissulaire caractéristique du foie est reconstituée en même temps qu’est rétablie dans les hépatocytes la capacité d’accumuler le glycogène. Le rôle des contacts spécifiques, établis entre les cellules d’une ébauche, sur la différenciation et l’activité fonctionnelle des éléments qui la composent a été démontré dans d’autres systèmes tels que le tissu cartilagineux (Holtzer & Abbott, 1968) et la rétine nerveuse (Moscona, 1971). Dans le cas du foie, il est vraisemblable que l’invasion du tissu mésenchymateux par les cellules endodermiques s’accompagne de processus de division. Quoiqu’il en soit, ces observations montrent que la dédifférenciation morphologique apparente des cellules parenchymateuses qui s’effectue en culture n’est pas irréversible. L’association des cultures primaires avec le mésenchyme hépatique organisé permet en effet de faire réapparaître dans ces cellules les caractères phénotypiques spécifiques du parenchyme hépatique. 11 est intéressant de souligner à cet égard que l’état de différenciation fonctionnelle des hépatocytes n’est stable que si les cellules sont placées dans des conditions d’environnement favorables. Le mésenchyme splanchnique qui s’est révélé indispensable à la différenciation de l’endoderme hépatique (Le Douarin, 1964; Le Douarin & Houssaint, 1967; Le Douarin, 1968; Houssaint, 1972) joue donc par la suite un rôle fondamental dans le maintien des caractères de la différenciation. Des expériences antérieures ont montré que l’interposition entre l’endoderme et le mésenchyme hépatique d’une seule couche de mésenchyme somitique suffit à empêcher la différenciation de l’endoderme en hépatocytes (Fontaine & Le Douarin, 1972). Les résultats que nous rapportons ici montrent que seules les cellules qui enhavissent le mésenchyme hépatique ou pulmonaire récupèrent une morphologie et un fonctionnement de type hépatique. 11 semble donc que les interactions cellulaires s’exerçant entre les deux constituants du foie, aussi bien au cours de l’organogenèse que dans le tissu hépatique différencié, ne peuvent s’effectuer que si les cellules établissent entre elles des contacts étroits.
RESUME
Des cultures cellulaires primaires sont établies à partir de foies d’embryons de caille de 8 jours. Au cours des trois premiers jours, la culture est constituée de plages épithéliales séparées par quelques cellules d’aspect fibroblastique. Le cytoplasme des cellules épithéliales est alors riche en glycogène décelable par la réaction histochimique à l’acide périodique Schiff (APS) contrôlée par le test de l’amylase salivaire. Au cours de l’évolution de la culture, les éléments fibroblastiques deviennent de plus en plus nombreux et après 6 à 7 jours, les plages épithéliales ont disparu et la culture est totalement fibroblastique. Aucune trace de glycogène ne peut alors y être décelée par la méthode à l’APS. La culture qui garde ensuite cet aspect a pu être prolongée dans certains cas jusqu’à 45 jours.
Des cultures primaires de 6 à 45 jours, ayant acquis un aspect purement fibroblastique, ont été associées à un mésenchyme d’origine splanchnique, hépatique ou pulmonaire. Ces cultures secondaires sont réalisées in vitro pendant 3 à 4 jours, soit sur un milieu de Wolff et Haffen soit sur un filtre millipore posé sur une grille de type Trowell. Dans certains cas, l’association est maintenue pendant deux jours en culture in vitro puis elle est prolongée en greffe in ovo pendant 6 jours. L’observation des cultures secondaires, fixées par le liquide de Gendre et traitées par la réaction à l’APS, montre que des cellules hépatiques ayant une structure épithéliale caractéristique et dont le cytoplasme est riche en glycogène sont présentes dans les expiants.
On peut conclure de cette observation que certains fibroblastes de la culture primaire sont en fait des cellules parenchymateuses apparemment dédifférenciées. Ces cellules gardent cependant la capacité de réexprimer leur détermination initiale quand on les associe à un mésenchyme splanchnique.
Le rôle des contacts cellulaires dans le maintien de la différenciation est envisagé dans la discussion.