Changes of electrolyte content in amphibian tissues during larval development, metamorphosis and regeneration

Measurements of sodium-, potassium- and water-content were made in amphibian tissues during normal postembryonic development and during various regenerative processes, specifically: (a) of whole larvae of Xenopus laevis curing larval development and metamorphosis, (b) of normally-growing hindlimbs of Xenopus laevis during larval development and metamorphosis, (c) of trunk and the tail, respectively, of X. laevis during the metamorphic climax, (d) of regenerating hindlimbs of Xenopus larvae, (e) of regenerating forelimbs of adult Triturus cristatus carnifex and (f) of heteromorphically regenerating forelimbs of adult X. laevis.

Drastic changes in electrolyte concentration were observed for all developmental processes studied and characteristic changes for certain developmental subprocesses like cell accumulation, proliferation and differentiation (see Table 2).

The changes in growth-rate (as measured by increase in dry weight) are compared with the changes in K/Na ratio in Xenopus larvae during prometamorphic development and in normally-growing Xenopus hindlimbs. The changes in growth-rate are positively correlated with the changes in K/Na ratio (Figs. 2, 4).

Mitotic activity in the normally-growing hindlimbs of Xenopus larvae and in regenerating forelimbs of adult Triturus was studied and compared with the changes in K/Na ratio. It was found that with increasing K/Na ratio the mitotic rates also increased, but beyond a certain level the mitotic frequency decreased (Figs. 4, 11).

The beginning of cell differentiation in normally-growing hindlimbs of Xenopus (Figs. 3,4), in regenerating hindlimbs of Xenopus larvae (Figs. 8, 9) and regenerating forelimbs of adult Triturus (Figs. 10,11) is concomitant with an increase in the potassium concentration and the K/Na ratio.

The possibility that electrolytes serve as regulators of growth and differentiation processes is discussed.

Wachstumsund Differenzierungsvorgänge während der Entwicklung eines Organismus werden letztlich durch die genetische Information gesteuert, die im Genom der Zellen vorliegt. Hierbei, handle es sich um einen Ontogeneseoder um einen Regenerationsprozeß, müssen Kontrollsysteme vorliegen, die bestimmen, wann und an welchem Ort genetische Einheiten aktiv und inaktiv werden. Man kann das Raum-Zeit-Muster einer Entwicklung geradezu als Manifestation des Raum-Zeit-Musters differentieller Genaktivitäten ansehen.

Auf der Suche nach einem Mechanismus, der die entsprechenden Regulationsleistungen vollbringen könnte, zeigte Kroeger (1963), daß sich das Puffmuster (Genaktivitätsmuster) der Polytänchromosomen explantierter Speicheldrüsen einer Insektenlarve durch bloBes Verändern der Na+und K+-Konzentration (bzw. des Na+/K+-Verhältnisses) im Inkubationsmedium ändern lä ßt. Kroeger u. Lezzi (1966) und Kroeger (1968) postulierten daraufhin, daßauch in der Normalentwicklung Elektrolyte in die Muster der Genaktivität steuernd eingreifen. Gestützt wurde diese Annahme durch den Nachweis, daß sich tatsächlich während der Normalentwicklung von Amphibienembryonen (Kostellow u. Morrill, 1968) und Fischembryonen (Beritashvili, Kvavilashvili u. Kafiani, 1969) die innerzelligen Na+und K+-Konzentrationen ändern.

In der vorliegenden Arbeit wird geprüft, (a) ob während der postembryonalen Entwicklung von Amphibien und bei der Normogenese und Regeneration von Amphibienextremitäten Gewebselektrolytveränderungen nachweisbar sind, und (b) ob solche Veränderungen mit speziellen Wachstumsund Differenzierungsvorgängen korreliert sind.

Tierhaltung. Als Versuchstiere dienten der Afrikanische Krallenfrosch (Xenopus laevis) und der Kamm-Molch (Triturus cristatus carnifex). Krallenfrösche wurden im hiesigen Labor gezüchtet, erwachsene Kamm-Molche wurden erworben von der Firma L. Haigund Co., Ltd., Newdigate/Surrey, England. Sämtliche Versuchstiere wurden in Glasaquarien bei einer Temperatur von 20 ± 1 °C gehalten. Erwachsene Krallenfräsche und Kamm-Molche erhielten zweimal wöchentlich fein geschnittene Rinderleber, Xenopus-Larven täglich eine Suspension feinen Brennesselpulvers; metamorphosierende Tiere bekamen Chironomus-Larven und Tubifex. Aile Aquarien waren mit einer Belüftungsanlage ausgestattet. Kaulquappen wurden in einer 0,01–0,02 %igen, erwachsene Tiere in einer 0,l%igen wä ßrigen Lösung von MS-222 (Sandoz, Basel) narkotisiert.

Gewebeentnahme und -aufarbeitung. (a) Bei der Normalentwicklung: Ich teilte die Entwicklungsstadien von Xenopus-Larven durchwegs nach der Normtafel von Nieuwkoop u. Faber (1967) ein. Mit Ausnahme von Frühstadien heranwachsender Xenopus-Hinterbeine wurden alle Gewebeproben in frischem Zustand gewonnen. Zur Messung der Elektrolyte während der Metamorphose warden die Tiere mit einer Rasierklinge in Rumpf, Schwanz and Hinterbeine zerlegt. Zar Gewinnang früher Stadien von Xenopas-Hinterextremitäten warden die ganzen Tiere in einem Aceton-Trockeneis-Gemisch eingefroren and die winzigen Knospen mit feinen Nadeln von den Larven abgetrennt.

(b) Bei der Extremitäten-Regeneration: Die Hinterbein-Knospen vonXeno-pas-Larven im Stadiam (St.) 51–52 wurden amputiert, indem die distale Knospenhälfte mit einer Uhrmacherpinzette erfaßt and mit einem feinen Skalpell abgetrennt warde. Regenerate einschließlich des Stampfgewebes habe ich mittels Uhrmacherpinzette and Iridectomieschere gewonnen. Die rechten Vorderextremitäten von adalten Xenopus and Triturus warden anmittelbar proximal vom Ellbogengelenk mit einer scharfen Rasierklinge ampatiert and anschliessend das etwas vorstehende Hameras-Ende mit einer Schere so zurückge-schnitten, daß Hameras and amliegendes Gewebe eine flache Wandebene bildeten.

Gewonnene Gewebeproben wurden schnell in kleine, tarierte Polyäthylen-Röhrchen transferiert, luftdicht verschlossen und zur Bestimmang des Frischgewichts gewogen. Nach Trocknung der Proben während mindestens 24 Stunden im Wärmeschrank bei 60 °C and einigen Stunden im Exsiccator bei Zimmertemperatar wurde das Trockengewicht bestimmt, und aus der Differenz von Frischund Trockengewicht der Wassergehalt berechnet. Die völlig trockenen Gewebeproben ließen sich quantitativ in Platintiegel oder mit Platin ausgelegte Quarztiegel übertragen. Die Veraschnng des biologischen Materials erfolgte in zwei Schritten: Zuerst wurden die Gewebe eine Stunde lang in einem Reihen-Glühofen bei 550 °C vorverascht. Nach dem Erkalten des Ofens wurde die fast weiße Asche mit 65%iger, analysenreiner Salpetersä;are befeachtet und für 30 Minuten wiederum bei 550 °C vollstä;ndig mineralisiert.

Probenanalyse. Die Aschenrückstände wurden in 6,5%iger Salpetersäure aufgenommen and die Elektrolyte Natrium und Kalium mit einem Flammenspektralfotometer ‘Beckman DU’ bei der Wellenlänge von 589,3 nm für Natrinm und 766,5 nm für Kalinm bestimmt. Eichand Analysenlösungen wurden mit Cäsiumchlorid and Alaminiumnitrat nach Angaben von Schuhknecht u. Schinkel (1963) gepuffert. Die Elektrolytkonzentrationen sind in der Regel in mmol/1 Gewebewasser angegeben, sodaß Wassergehaltsveränderangen der Gewebe berücksichtigt sind. War ein gewisser Wasserverlust wegen extrem geringer Gewebemasse unvermeidbar, so wurden die Konzentrationsangaben in mmol/100 g Trockensubstanz gemacht.

Bestimmung der Wachstumsrate (WR). Als Index für das Wachstum ganzer Xenopus-Larven und ihrer Hinterbeine wurde die prozentaale Trockensubstanzzunahme pro Zeiteinheit (Tag) von Probenahme zu Probenahme nach folgender Formel berechnet:
formula
WR ( %) = Wachstumsrate in %,

TGn+1 = Trockengewicht zum Zeitpunkt tn+1,

TGn = Trockengewicht zum Zeitpunkt tn,

tn+ –tn= Zeitintervall zwischen zwei aufeinander folgenden Probenahmen in Tagen.

Histologische Untersuchungen. Ganze Xenopus-Larven und regenerierende Molch-Vorderbeine wurden drei Tage lang in Bouin’scher Lösung fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Darauf wurden 7 μm dicke Längsschnitte von Xenopus-Hinterbeinknospen und Molch-Vorderbeinregeneraten hergestellt. Die Schnitte wurden mit saurem Hämalaun nach Mayer und mit Eosin gefärbt und in Caedax eingeschlossen. An diesen Präparaten konnte die Mitosenrate, ausgedrückt als Anzahl Mitosen je Flächeneinheit (mm2) des histologischen Schnittes, bestimmt werden.

I. Untersuchungen an ganzen Krallenfröschen und an einzelnen Gewebekomplexen während der Normalentwicklung

Tabelle 1 gibt einen Überblick über äußere und innere morphologische Veränderungen von ganzen Xenopus-Larven und ihren Organen, Hinterbeine und Schwanz, während der postembryonalen Entwicklung. Über die Biochemie der Anuren-Metamorphose berichten unter andern Autoren: Weber (1967), Etkin (1968), Cohen (1970), Frieden (1961) und Frieden u. Just (1970).

A. Elektrolytveränderungen und Wachstumsrate von ganzen Krallenfröschen während der Larvenentwicklung und Metamorphose

Die Veränderungen des Natriumund Kaliumgehaltes (in mM/1. Gewebewasser) und des Wassergehaltes (in % des Frischgewichtes) ganzer Larven zeigt Abb. 1 über die volle postembryonale Entwicklung hinweg.

Abb. 1.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in ganzen Larven von Xenopus laevis während der Larvenentwicklung und Metamorphose. Jeder Kurvenpunkt stell t den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben während der Prâund Prometamorphose, jedoch von je 7 Einzel-bestimmungen während der Klimax, dar. Jede Sammelprobe enthâlt 12-30 In-dividúen. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet. -Abszisse: Entwicklungsstadien und Larvenalter nach Nieuwkoop u. Faber (1967).

Abb. 1.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in ganzen Larven von Xenopus laevis während der Larvenentwicklung und Metamorphose. Jeder Kurvenpunkt stell t den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben während der Prâund Prometamorphose, jedoch von je 7 Einzel-bestimmungen während der Klimax, dar. Jede Sammelprobe enthâlt 12-30 In-dividúen. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet. -Abszisse: Entwicklungsstadien und Larvenalter nach Nieuwkoop u. Faber (1967).

In der prämetamorphen Phase, d. h. nach dem Schlüpfen der Embryonen aus den Eihüllen, erfolgt in den nun freischwimmenden Larven während St. 35 – 41 ein Natriumund Kaliumanstieg (Na-Zunahme um mehr als 300%; K-Erhöhung um 13%). Ab St. 41 bis fast zum Ende der prämetamorphen Phase steigt dann in den Tieren die Natriumund fällt die Kaliumkonzentration. Die Summe der beiden Elektrolyte steigt während der Prämetamorphose von Stadium zu Stadium exponentiell und erreicht am Ende dieser Phase ein Maximum (Zunahme von 45 auf 80 mM/1.). Parallel nimmt der Wassergehalt zu. Während der prometamorphen Phase, der Période des ausgeprägten Larvenwachstums, sinkt der Natriumgehalt der Tiere, der Kaliumgehalt steigt, und zwar ist der Feinverlauf der beiden Kurven von St. 48 bis St. 61 in der Regel gegensinnig. Ab St. 61 bis zum Ende der Metamorphose verlaufen sie dagegen gleichsinnig. Während der ganzen Prometamorphose und Metamorphose-Klimax nimmt der Wassergehalt kontinuierlich ab (Abnahme um ca. 10%).

Als Maß für die Wachstumsrate (WR) der Kaulquappen verwende ich die prozentuale Trockensubstanzzunahme pro Tag (siehe: Material und Methoden). Die Trockengewichtswerte stammen jeweils von den gleichen Tiergruppen wie die Elektrolytwerte. Vergleicht man während der prometamorphen Wachstumsphase die Veränderungen des K/Na-Verhältnisses mit den Veränderungen der Wachstumsrate (Abb. 2), so stellt man fest, daß sich diese beiden GröBen in der Regel gleichsinnig ändern. Statistisch ist nachgewiesen, daß die Veränderungen des K/Na-Quotienten (ΔK/Na) mit den Veränderungen der Wachstumsrate (ΔWR) positiv korreliert sind (Irrtumswahrscheinlichkeit P < 0,05).

Abb. 2.

Veränderungen des K/Na-Verhâltnisses und der Wachstumsrate (WR) ganzer Larven von Xenopus laevis während der Prometamorphose. - K/Na-Kurve: Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben, bestehend aus je 12 bis 30 Individúen, dar. - Wachstumsrate: WR = prozentuale Trockensubstanzzunahme pro Tag. n = Totalanzahl der pro MeBpunkt einbezogenen Larven.

Abb. 2.

Veränderungen des K/Na-Verhâltnisses und der Wachstumsrate (WR) ganzer Larven von Xenopus laevis während der Prometamorphose. - K/Na-Kurve: Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben, bestehend aus je 12 bis 30 Individúen, dar. - Wachstumsrate: WR = prozentuale Trockensubstanzzunahme pro Tag. n = Totalanzahl der pro MeBpunkt einbezogenen Larven.

B. Elektrolytveränderungen in Gewebekomplexen von Krallenfröschen während der Larvenentwicklung und Metamorphose

(1) Elektrolytveränderungen, Wachstumsrate und mitotische Aktivität in den Hinterbeinen von Krallenfröschen während der Larvenentwicklung. Beim Heranwachsen der Hinterbeine folgen einander: (1) eine Phase (St. 43–46), in der sich Mesenchymzellen unter der Epidermis der kümftigen Hinterbeinregion ansammeln, (2) eine Proliferationsphase (bis St. 51) und (3) eine Differenzierungsphase (ab. St. 51). Die gleichzeitig ablaufenden morphologischen Veränderungen der wachsenden Hinterbeine sind zusammengestellt in Tabelle 1.

Abb. 3 zeigt die Elektrolytkonzentrationen (in mM/100 g Trockensubstanz) von Krallenfrosch-Hinterbeinen in verschiedenen Entwicklungsstadien : Während der Proliferationsphase (St. 49–51) sinkt der Natriumund Kaliumgehalt, mit dem Beginn der Zelldifferenzierung steigen die Werte für beide Elektrolyte extrem. Dann sinken sie wieder, wobei anders als im differenzierten Bein (Abb. 3, nM) ab St. 52 stets mehr Kalium als Natrium gemessen wird. Die Knospen von St. 49 bis 51 enthalten 90–95 % Wasser; ab St. 51 nimmt der Wassergehalt nach und nach ab und erreicht bei St. 55 einen in der Folge konstant bleibenden Wert von 85 ± 3 %.

Abb. 3.

Veränderungen des Natrium- und Kaliumgehaltes in normogenetisch heranwachsenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar. Diese bestehen aus je 40-80 Einzelknospen bis Stadium 55, bzw. je 10 Beinen nach Stadium 55. nM = nach Metamorphose.

Abb. 3.

Veränderungen des Natrium- und Kaliumgehaltes in normogenetisch heranwachsenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar. Diese bestehen aus je 40-80 Einzelknospen bis Stadium 55, bzw. je 10 Beinen nach Stadium 55. nM = nach Metamorphose.

In Abb. 4 sind die K/Na-Quotienten, die mitotische Aktivität (MR) und die tägliche Trockensubstanzzunahme in Prozent (Wachstumsrate WR) aufgezeichnet: Vergleicht man die Veränderungen dieser drei Grö ßen stadienweise, so stellt man fest, daß (1) parallel mit der Zunahme des K/Na-Quotienten bis zu einem bestimmten Wert (St. 49–50) die mitotische Aktivität zunimmt, diese jedoch abnimmt bei weiterem Ansteigen des K/Na-Verhältnisses, (2) die Verän-derungen des K/Na-Quotienten mit den Veränderungen der Wachstumsrate positiv korreliert sind (Irrtumswahrscheinlichkeit P < 0,05), und (3) auf die Zunahme der mitotischen Aktivität eine Zunahme der Wachstumsrate folgt.

Abb. 4.

Veränderungen des K/Na-Quotienten, der Mitosenrate (MR) und der Wachstumsrate (WR) in normogenetisch heranwachsenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). - K/Na-Kurve: Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar; diese bestehen aus je 40-80 Einzelknospen bis Stadium 55, bzw. je 10 Beinen nach Stadium 55. - Die MR wurde an 7/ μ m dicken Lângsschnitten bestimmt; jeder MR-Kurvenpunkt stellt den Mittelwert + Standardfehler des Mittelwertes von je 5-10 Bestimmungen dar. - Wachstumsrate : WR = prozentuale Trockensubstanzzu-nahme pro Tag. n = Totalanzahl der pro MeBpunkt einbezogenen Beine.

Abb. 4.

Veränderungen des K/Na-Quotienten, der Mitosenrate (MR) und der Wachstumsrate (WR) in normogenetisch heranwachsenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). - K/Na-Kurve: Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar; diese bestehen aus je 40-80 Einzelknospen bis Stadium 55, bzw. je 10 Beinen nach Stadium 55. - Die MR wurde an 7/ μ m dicken Lângsschnitten bestimmt; jeder MR-Kurvenpunkt stellt den Mittelwert + Standardfehler des Mittelwertes von je 5-10 Bestimmungen dar. - Wachstumsrate : WR = prozentuale Trockensubstanzzu-nahme pro Tag. n = Totalanzahl der pro MeBpunkt einbezogenen Beine.

(2) Elektrolytveränderungen im Rumpf, Schwanz und in den Hinterbeinen von Krallenfröschen während der Metamorphose-Klimax. Natriumund Kaliumgehaltsänderungen (in mM/1. Gewebewasser) und die Veränderungen des Wassergehaltes im Rumpf, im Schwanz und in den Hinterbeinen während der Metamorphose-Klimax sind dargestellt in Abb. 5, Abb. 6 und Abb. 7 : Gegen Ende der prometamorphen Phase (St. 56) liegen im Rumpf und Schwanz ähnliche Elektrolytkonzentrationen vor. Während der Klimax steigt der Natriumund Kaliumgehalt im Rumpf (Abb. 5) nur schwach an, hingegen im regredierenden Schwanz (Abb. 6) extrem. Der Wassergehalt nimmt im Rumpf schwach, im regredierenden Schwanz sehr stark ab.

Abb. 5.

Veränderungen des Natrium-, Kalium-und Wassergehaltes im Rumpf von Xenopus laevis während der Metamorphose-Klimax. Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben, beste-hend aus je 3 Rümpfen, dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet.

Abb. 5.

Veränderungen des Natrium-, Kalium-und Wassergehaltes im Rumpf von Xenopus laevis während der Metamorphose-Klimax. Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben, beste-hend aus je 3 Rümpfen, dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet.

Abb. 6.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes im Schwanz von Xenopus laevis während der Metamorphose-Klimax. Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben, bestehend aus je 3-6 Schwânzen, dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet.

Abb. 6.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes im Schwanz von Xenopus laevis während der Metamorphose-Klimax. Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3 oder 4 Sammelproben, bestehend aus je 3-6 Schwânzen, dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet.

Abb. 7.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in den Hinterbeinen von Xenopus laevis während der Metamorphose-Klimax. Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 4 Sammelproben, bestehend aus je 4-6 Beinen, dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet.

Abb. 7.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in den Hinterbeinen von Xenopus laevis während der Metamorphose-Klimax. Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 4 Sammelproben, bestehend aus je 4-6 Beinen, dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet.

Ganz andere Elektrolytkonzentrationen als im Rumpf und Schwanz linden wir schon zu Beginn der Metamorphose-Klimax in den stark wachsenden Hinterbeinen (Abb. 7). Sie sind im Gegensatz zum Rumpf und Schwanz über die ganze Metamorphose hinweg reicher an Kalium als an Natrium. Der Wassergehalt der Beine bleibt nahezu konstant.

II. Untersuchungen an regenerierenden Extremitäten von Krallenfröschen und Kamm-Molchen

A. Elektrolytveränderungen in vollständig regenerierenden Extremitäten

Krallenfrosch-Larven und adulte Kamm-Molche regenerieren Extremitäten nicht auf die gleiche Weise: Wä hrend im Krallenfrosch-Larvenbeinstumpf noch weitgehend embryonale Zellen vorliegen (Dent, 1962; Bergerhoff, 1966), die sich unter dem Wundepithel zu einem Blastem ansammeln, werden im Beinstumpf des adulten Molches teilungsfähige Blastemzellen aus vollständig differenzierten Zellen durch einen Dedifferenzierungsvorgang hergestellt (Thornton, 1938; Butler u. Schotté, 1941; Hay, 1959,1962, 1966). Ich habe die Elektrolytveränderungen während dieser und der nachfolgenden, dann bei beiden Tieren prinzipiell gleichartig verlaufenden Proliferationsund Differenzierungsphase untereinander und mit den Veränderungen im normal auswachsenden Xenopus-Larvenbein verglichen.

(1) Elektrolytverdnderungen in regenerierenden Hinterbeinen von KrallenfroschLarven. Nach Dent (1962) erfolgt innerhalb weniger Stunden nach Amputation der Wundverschluß und wßhrend der ersten zwei Tage eine Akkumulation von embryonalen Zellen unter der Wundepidermis. Durch Proliferation der Blastemzellen wßchst das Regenerat und zeigt sechs Tage nach Amputation einen konusförmigen Umritß. Neun Tage nach Amputation erkennt man eine schwache Eindellung in der Region des künftigen Kniegelenkes und eine Abflachung des distalen Knospenteiles. Ab St. 54–55 entwickelt sich das Regenerat, obwohl es zunächst noch kleiner ist, synchron mit dem intakten, kontralateralen Bein (siehe dazu: Tab. 1).

Table 1.

Morphologische Veranderungen wcihrend der Larvenentwicklung und Metamorphose von Xenopus laevis Zusammengestellt aus: Nieuwkoop u. Faber (1967).

Morphologische Veranderungen wcihrend der Larvenentwicklung und Metamorphose von Xenopus laevis Zusammengestellt aus: Nieuwkoop u. Faber (1967).
Morphologische Veranderungen wcihrend der Larvenentwicklung und Metamorphose von Xenopus laevis Zusammengestellt aus: Nieuwkoop u. Faber (1967).
Table 2.

Elektrolytveranderungen in normogenetisch heranwachsenden und regenerierenden Amphibien-Extremitaten

Elektrolytveranderungen in normogenetisch heranwachsenden und regenerierenden Amphibien-Extremitaten
Elektrolytveranderungen in normogenetisch heranwachsenden und regenerierenden Amphibien-Extremitaten

Zu verschiedenen Zeiten nach Amputation der Hinterbeine im St. 51–52 wurde jeweils die ganze regenerierende Extremität auf ihren Elektrolytgehalt hin analysiert (Abb. 8) : Parallel mit der Akkumulation von Regenerationszellen (Larven-St. 51–52) unter der Wundepidermis steigt im Stumpfgewebe der Natriumgehalt stark an, der Kaliumgehalt nimmt schwach ab. Wie bei der Hinterbein-Normogenese von Xenopus (Abb. 3: St. 49–51) sinkt bei starker mitotischer Aktivität der Blastemzellen (St. 52–53) die Natriumwie Kaliumkonzentration; wie bei der Hinterbein-Normogenese von Xenopus (Abb. 3: St. 51–51) steigt die Kaliumkonzentration mit beginnender Zelldifferenzierung (St. 53–54) an. Der Wassergehalt regenerierender Extremitäten liegt wie der intakter Beine bei 85 ± 3 %.

Abb. 8.

Veränderungen des Natriumund Kaliumgehaltes in ganzen regenerierenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar. Diese bestehen aus 6-12 Beinen bis Stadium 56, bzw. je 3 Beinen nach Stadium 56. - Amp. = Zeitpunkt der Amputation; A = Akkumulation von Blastemzellen; Prolif. = Proliferation der Blastemzellen ; nM = nach Metamorphose.

Abb. 8.

Veränderungen des Natriumund Kaliumgehaltes in ganzen regenerierenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar. Diese bestehen aus 6-12 Beinen bis Stadium 56, bzw. je 3 Beinen nach Stadium 56. - Amp. = Zeitpunkt der Amputation; A = Akkumulation von Blastemzellen; Prolif. = Proliferation der Blastemzellen ; nM = nach Metamorphose.

Veränderungen des K/Na-Verhältnisses (Abb. 9): Wie bei der Normalentwicklung der Xenopus-Hinterbeine (siehe Abb. 4) findet man auch im Hinterbeinregenerat einen ansteigenden Quotienten bei zunehmender mitotischer Aktivität und ein weiteres Ansteigen des K/Na-Wertes mit dem Einsetzen der Zelldifferenzierung.

Abb. 9.

Abb. 9. Veränderungen des K/Na-Quotienten in ganzen regenerierenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar. Diese bestehen aus je 6-12 Beinen bis Stadium 56, bzw. je 3 Beinen nach Stadium 56. Amp. = Zeitpunkt der Amputation ; A = Akkumulation von Blastemzellen ; Prolif. — Proliferation der Blastemzellen; nM = nach Metamorphose.

Abb. 9.

Abb. 9. Veränderungen des K/Na-Quotienten in ganzen regenerierenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von 3-5 Sammelproben dar. Diese bestehen aus je 6-12 Beinen bis Stadium 56, bzw. je 3 Beinen nach Stadium 56. Amp. = Zeitpunkt der Amputation ; A = Akkumulation von Blastemzellen ; Prolif. — Proliferation der Blastemzellen; nM = nach Metamorphose.

(2) Elektrolytveränderungen und Veränderungen der mitotischen Aktivität in regenerierenden Vorderbeinen von ausgewachsenen Katnm-Molchen. Beim Regenerationsprozeß folgt auf die Wundheilungsphase die Dedifferenzierungsoder Blastembildungsphase, dann die Proliferationsund die Differenzierungsphase. Morphologische und histologisch-cytologische Veränderungen des regenerierenden Triturus-Vorderbeines beschreiben Singer (1952) und Schmidt (1968).

Um auch Informationen über Elektrolytund Wassergehaltsveränderungen während der frühen Phasen (Wundheilung, Dedifferenzierung) zu erhalten, wurden die Bestimmungen nicht nur an regeneriertem Gewebe, sondern an solchem in Verbindung mit einem ca. 1 mm dicken Gewebezylinder des Stumpfes, vorgenommen. Ausgangspunkt der Kurven ist jeweils die Konzentration der Elektrolyte von proximal vom Ellbogengelenk liegenden, 1 mm dicken Gewebezylindern unamputierter Vorderbeine. Außerdem dienten solche Gewebezylinder unbehandelter Tiere über die gesamte Dauer des Experimentes hinweg als Kontrollen, um éventuelle Elektrolytveranderungen auf Grund unbekannter Einflüsse (Futter, Narkosemittel, hormonale Veränderungen usw.) zu erfassen. Diese umfangreichen ‘Nullkontrollen’ (15 Kontrollanalysen an je 10 Tieren) ergaben, daß die Elektrolytkonzentrationen und der Wassergehalt in diesen unbehandelten Extremitätengeweben während der ganzen Versuchsdauer konstant waren.

Die Elektrolytund Wassergehaltsveränderungen während des ganzen Regenerationsprozesses im Regenerat einschließlich eines 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfes sind dargestellt in Abb. 10: Während der ersten 10 Tage nach Amputation, der Wundheilungsund Blastembildungsphase, nimmt im distalen Stumpfgewebe der Natriumund Kaliumgehalt beträchtlich ab. Vom 12. bis 14. Tage nach Amputation, der Zeit der Blastemzellenansammlung unter der apikalen Epidermis, nimmt Natrium zu und Kalium ab, was auch im amputierten Hinterbein von Xenopus-Larven (siehe Abb. 8: St. 51–51 1/2) bei einem vergleichbaren histologischen Vorgang registriert wurde. Mit zunehmender mitotischer Aktivität im Blastem (ca. 15 Tage nach Amputation) sinkt die Natriumwie die Kaliumkonzentration ab. Dieselbe Parallelität wurde sowohl im normogenetisch heranwachsenden (siehe Abb. 3 : St. 49–51), als auch im regenerierenden Hinterbein von Xenopus-Larven (siehe Abb. 8: St. 52–53) festgestellt. Bei allen drei Organentwicklungsprozessen steigt mit beginnender Zelldifferenzierung die Kaliumkonzentration in den Geweben.

Abb. 10.

Abb. 10. Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in VorderbeinRegeneraten, einschlieBlich eines ca. 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfes, von adulten Kamm-Molchen (Trituras cristatus carnifex). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 12 Einzelbestimmungen dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet. Stadienbezeichnungen : FKS = Frühes Knospen-Stadium, MKS = Midieres Knospen-Stadium, SKS = Spates Knospen-Stadium, PS = Paddel-Stadium, 2FS = 2 Fingerknospen-Stadium, 3FS = 3 Fingerknospen-Stadium, 4FS = 4 Fingerknospen-Stadium.

Abb. 10.

Abb. 10. Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in VorderbeinRegeneraten, einschlieBlich eines ca. 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfes, von adulten Kamm-Molchen (Trituras cristatus carnifex). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 12 Einzelbestimmungen dar. Extrem kleine Standardfehler sind nicht eingezeichnet. Stadienbezeichnungen : FKS = Frühes Knospen-Stadium, MKS = Midieres Knospen-Stadium, SKS = Spates Knospen-Stadium, PS = Paddel-Stadium, 2FS = 2 Fingerknospen-Stadium, 3FS = 3 Fingerknospen-Stadium, 4FS = 4 Fingerknospen-Stadium.

In Abb. 11 wird die mitotische Aktivität in Regeneraten (inklusive eines 1 mm dicken proximalen Gewebeteils) während der Proliferationsund Differenzierungsphase mit den Veränderungen des K/Na-Verhältnisses verglichen : Wie im heranwachsenden Hinterbein von Xenopus-Larven (siehe Abb. 4) steigt mit der Zunahme des K/Na-Quotienten bis zu einem bestimmten Wert die Mitosenanzahl, sie nimmt jedoch ab bei weiterem Ansteigen des K/NaVerhältnisses.

Abb. 11.

Veränderungen des K/Na-Quotienten und der Mitosenrate (MR) in Vorderbein-Regeneraten, einschlieBlich eines ca. 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfes, von adulten Kamm-Molchen (Triturus cristatus carnifex). K/Na-Kurve: Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 12 Einzelbestimmungen dar. Die MR wurde an 7 / μ m dicken Lângsschnitten bestimmt; jeder MR-Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 10 Bestimmungen dar.

Abb. 11.

Veränderungen des K/Na-Quotienten und der Mitosenrate (MR) in Vorderbein-Regeneraten, einschlieBlich eines ca. 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfes, von adulten Kamm-Molchen (Triturus cristatus carnifex). K/Na-Kurve: Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 12 Einzelbestimmungen dar. Die MR wurde an 7 / μ m dicken Lângsschnitten bestimmt; jeder MR-Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 10 Bestimmungen dar.

B. Elektrolytveränderungen in unvollständig regenerierenden Extremitäten

Im allgemeinen vertieren Anuren-Larven im Laufe der Metamorphose die Regenerationsfähigkeit. Bei Krallenfrosch-Larven nimmt diese Fähigkeit schon während prometamorpher Entwicklungsstadien kontinuierlich ab (Dent, 1962), geht jedoch nicht vollständig verloren. Auch postmetamorphe Tiere sind noch imstande, ein hypomorphes, eingeschränkt differenziertes Regenerat zu bilden. Die Histogenese solcher Regenerate beschreiben Beetschen (1952), Komala (1957) und Skowron u. Komala (1957).

Zu verschiedenen Zeiten nach Amputation der rechten Vorderbeine von postmetamorphen, 3 1/2 –4 1/2 g schweren Krallenfröschen, wurden heteromorphe Regenerate einschließlich eines 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfesauf ihren Natrium-, Kaliumund Wassergehalt untersucht (Abb. 12). Als Ausgangspunkt der Kurven ist jeweils die Konzentration der Elektrolyte von proximal vom Ellbogengelenk liegenden, 1 mm dicken Gewebezylindern unamputierter Vorderbeine angegeben.

Abb. 12.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in heteromorphen Vorderbein-Regeneraten, einschlieBlich eines ca. 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfes, von postmetamorphen Krallenfrôschen (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 10 Einzelbestimmungen dar.

Abb. 12.

Veränderungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes in heteromorphen Vorderbein-Regeneraten, einschlieBlich eines ca. 1 mm dicken Gewebezylinders des Stumpfes, von postmetamorphen Krallenfrôschen (Xenopus laevis). Jeder Kurvenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes von je 10 Einzelbestimmungen dar.

Während der ersten drei Tage nach Amputation erfolgt im distalen Stumpfgewebe des Krallenfroschbeines eine drastische Elektrolyterhöhung (NaZunahme um mehr als 100 %; Kaliumerhohung um ca. 68 %), ganz im Gegensatz zur Reaktion der Stumpfgewebe vollständig regenerierender Extremitaten von Kamm-Molchen (siehe Abb. 10). Parallel mit dem Abklingen der nach der Amputation aufgetretenen starken Entzündungserscheinungen sinkt während der zweiten Wochenhälfte nach Amputation die Natriumund Kaliumkonzentration auf die Ausgangswerte ab und verändert sich während der folgenden Wochen nur noch geringfügig. Der Wassergehalt steigt im distalen Stumpfgewebe während der ersten vier Tage nach Amputation von ca. 71 % auf ca. 89 % an und schwankt später um 85 % ( ± 3 %).

Daß überhaupt Elektrolytund Wassergehaltsveränderungen in den verschiedensten Vertebratengeweben während der Ontogenese auftreten, beschreiben Dickerson (1960), Dickerson u. Widdowson (1960), Reimold (1962), Draper (1968), Luff u. Goldspink (1970), Skul’skii, Baklanova, Burovina u. Leont’ev (1970) und andere Autoren. Speziell für die Larvenentwicklung von Amphibien legt Keiser (1925) entsprechende Daten vor. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß bei Entwicklungsprozessen von Anuren und Urodelen, in ganzen Tieren wie in einzelnen Organen, konkrete ‘Muster’ von Elektrolytveränderungen in den Geweben durchgespielt werden, und daß diese fßr spezielle Wachstumsund Differenzierungsvorgänge typisch sind.

Aus den gemessenen Natriumund Kaliumkonzentrationen in Gewebekomplexen, bzw. Organen, läBt sich zunächst nicht ableiten, welche Anteile extraund welche intrazellulär vorliegen. Immerhin lä ßt sich hieriiber mittelbar einiges aussagen: In einem der untersuchten Prozesse, nämlich im regenerierenden Triturusbein, sind die Veränderungen der extraund intrazellulären Volumenanteile des Gewebes bekannt (Chalkley, 1954); die kontinuierliche Zunahme des extrazellulären Raumes während der ersten 13 Tage nach Amputation und die anschließend ebenso gleichmäBige Abnahme korrespondieren keineswegs mit den Elektrolytveränderungen (siehe Abb. 10). Ferner ist wie bei den meisten Organismen auch bei den Amphibien Natrium vorwiegend extrazellulär, Kalium zum gröBten Teil intrazellulär lokalisiert (Deyrup, 1964; Ferreri, Socino, Mazzi u. Peyrot, 1964). Damit ist es unwahrscheinlich, daß die bei alien untersuchten Prozessen gefundenen, sehr starken Natriumund Kaliumverän- derungen durch bloße GröBenveränderungen des extrazellulären Raumes zustande kommen; mit Sicherheit ist dies sogar in jenen häufigen Fällen auszuschließen, bei denen für Natrium und Kalium gleichsinnige Veränderungen registriert wurden. Somit scheint die Annahme berechtigt, daß die bei den untersuchten Entwicklungsprozessen gemessenen Elektrolytveränderungen weitgehend Veränderungen des innerzelligen Elektrolytmilieus wiederspiegeln. Daß sich wirklich innerzellige Elektrolytkonzentrationen während der Entwicklung ändern können, haben Kostellow u. Morrill (1968) und Beritashvili u. a. (1969) an Amphibienund Fischembryonen, Vernadakis u.Woodbury (1964) und Martynenko (1963) an Muskelzellen von Ratten nachgewiesen.

Ändern sich innerzellige Elektrolytkonzentrationen während der Entwicklung, so stellt sich die Frage nach der zellphysiologischen Bedeutung dieser Vorgänge. Eine Vielzahl von Geschehnissen in der Zelle hängt vom Alkalimetallionentiter ab (Zusammenfassende Darstellung von Ussing u. a. 1960): Lubin (1967) zeigte an Sarcoma-Zellkulturen und Kroeger (persönliche Mitteilung) an explantierten Insektengeweben, daß sich die allgemeinen Syntheseraten (DNS-, RNSund Proteinsynthese) durch anorganische lonen steuern lassen. Kroeger (1963) konnte qualitative Unterschiede in der Reaktion einzelner Stellen im Genom auf bestimmte Elektrolytkonzentrationen nachweisen. Kuchler (1967) fand an kultivierten Mäusefibroblasten eine direkte Abhangigkeit der Zellteilungsund Proteinsyntheserate vom K/Na-Verhältnis im Kulturmedium : Die Zellteilungsund Proteinsyntheserate der LM-Zellpopulationen nimmt beim Erhöhen des K/Na-Verhältnisses zu, erreicht bei einem bestimmten Wert ein Maximum, und nimmt beim Überschreiten des ‘optimalen’ K/Na-Verhältnisses wieder ab.

Indizien dafür, daß auch bei den in dieser Arbeit untersuchten Entwicklungsprozessen Elektrolyte solche Steuerfunktionen haben, bilden folgende Feststellungen:

(1) Die Veränderungen des K/Na-Verhältnisses in ganzen Xenopus-Larven (siehe Abb. 2) sowie in Xenopus-Hinterbeinen (siehe Abb. 4) sind positiv korreliert mit den Veränderungen der Wachstumsrate (IrrtumswahrscheinlichkeitP < 0,05).

(2) Die mitotische Aktivität nimmt parallel mit der Zunahme des K/NaQuotienten bis zu einem bestimmten Wert im Xenopus-Larvenbein (siehe Abb. 4) und im regenerierenden Triturusbein (siehe Abb. 11) zu (vgl. Kuchler, 1967).

(3) Ein Vergleich der Veränderungen des Natriumund Kaliumgehaltes sowie des K/Na-Quotienten bei den drei in dieser Arbeit untersuchten Organentwicklungsprozeßenzeigt, dass mit bestimmten zellulären Prozessen (z.B.: Zelldifferenzierung) stets bestimmte charakteristische Elektrolytverànderungen einhergehen (Tab. 2).

Für eine Steuerung der Genaktivität durch anorganische lonen sprechen auch die Ergebnisse von Barth u. Barth (1969), die zeigen, daß die Differenzierung von Zellen zu bestimmten Typen durch Elektrolyte beeinflußt wird : Die Autoren können durch bloBes Verändern der Konzentrationen von anorganischen lonen im Kulturmedium die Differenzierung von präsumptiven Rana-pipiens-Epidermiszellen in andere Bahnen lenken, sodaß verschiedene Zelltypen resultieren. Sogar eine Dedifferenzierung von bereits vollständig differenzierten Zellen kann mit bestimmten lonen induziert werden, wie Macklin u. Burnett (1966) an isolierten Gastrodermiszellen von Hydra gezeigt haben (Dedifferenzierung von Driisenzellen in pluripotente Neoblasten). Damit lä mit bestimmten Ionen induziert werdent sich vermuten, daß die fur die Extremitatenregeneration bei Urodelen notwendige Dedifferenzierung von Zellen in Wundnàhe durch Elektrolyte bewerkstelligt sein könnte.

Die von mir vorgelegten Daten zeigen Parallelitäten zwischen Elektrolytveränderungen und Entwicklungsereignissen, für ursächliche Zusammenhange lassen sie nur Vermutungen zu. Betrachtet man sie jedoch im Zusammenhang mit den Befunden über steuernde Wirkungen von Elektrolyten (siehe oben), legen sie die Möglichkeit einer Regulationsfunktion der Elektrolyte bei natürlichen Entwicklungsvorgängen, wie Wachstumsund Differenzierungsprozessen, nahe.

Messungen des Natrium-, Kaliumund Wassergehaltes von Amphibiengeweben während der postembryonalen Entwicklung und während verschiedener Regenerationsprozesse wurden durchgeführt : (a) an ganzen Larven von Xenopus laevis während der gesamten Larvenentwicklung und Metamorphose, (b) an normogenetisch auswachsenden Hinterbeinen von X. laevis während der Larvenentwicklung und Metamorphose, (c) am Rumpf und Schwanz von X. laevis während der Metamorphose-Klimax, (d) an regenerierenden Hinterbeinen von Xenopus-Larven, (e) an regenerierenden Vorderbeinen von adulten Triturus cristatus carnifex und (f) an heteromorph regenerierenden Vorderbeinen von adulten X. laevis.

Mehrere Unterprozesse der Entwicklung und Regeneration sind zeitlich verbunden mit drastischen Elektrolytveränderungen, und zwar: (a) Die Veränderungen der Wachstumsrate (Trockensubstanzzunahme) von ganzen Ae/7opw5-Larven und ihren Hinterbeinen sind positiv korreliert mit den Veränderungen des K/Na-Verhältnisses, (b) parallel mit der Zunahme der mitotischen Aktivität nimmt der K/Na-Quotient zu und (c) mit dem Beginn der

Zelldifferenzierung nimmt die Kaliumkonzentration und das K/Na-Verhältnis in den Geweben zu. Das zeitliche Zusammenfallen der unter (b) und (c) aufgeführten Entwicklungsereignisse mit typischen Elektrolytveränderungen gilt sowohl fiir Normalentwicklungsvorgänge wie auch für Regenerationsprozesse.

Die Möglichkeit einer Regulationsfunktion der Elektrolyte bei Wachstumsund Differenzierungsprozessen wird diskutiert.

Ich danke meinen geschätzten Lehrern, Herrn Prof. Dr H. Ulrich am Zoologischen Institut der ETH in Zürich und Herrn Prof. Dr H. Kroeger am Institut für Genetik an der Universität des Saarlandes in Saarbrücken für die Förderung meiner Arbeit. GroBen Dank schulde ich auch Fri. M. Haubert, Technische Assistentin am Institut für Genetik an der Universität des Saarlandes, für die tatkräftige Mithilfe bei der Durchftihrung der Versuche und der Gestaltung der Graphiken.

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