Histological examination of gonads from teleosts, cultivated in vitro on an agar medium containing glucose and chick embryo extract shows the continuation of the germinal activity for at least 21 days. The influence of different factors: stage of maturation at the time of explantation, quantity of nutrient available, and transfer on fresh media are checked. The best results are obtained for ovaries containing only young oocytes, i.e. before any vitellogenesis or when it has just started, and for testes in which spermatogenesis is well advanced, i.e. when there are numerous spermatozoa. Results do not seem to be improved by frequent transfers.

First attempts of association with pituitary gland or gonads of the opposite sex are reported.

Pour tenter de trouver l’explication du mécanisme de la différenciation sexuelle, en l’occurrence chez les Téléostéens, les résultats de l’administration d’hormones in vivo sont un apport précieux. Cependant, ces résultats ne se laissent pas toujours interpréter avec toute la clarté désirable. L’un de nous (C. Remade, 1970) en a fait l’expérience antérieurement, et les conclusions demeuraient fort approximatives. Afin de supprimer les interactions hormonales et autres, il nous a semblé intéressant d’isoler les glandes génitales de Téléostéens, et par conséquent, d’employer la méthode de culture organotypique. Cette méthode a été employée avec succès chez les Oiseaux, Mammifères, Reptiles et Batraciens (voir les revues générales faites par d’E. Wolff & Haffen, 1965, et Haffen, 1965), ainsi qu’au laboratoire pour les glandes génitales d’insectes (J. Demal, 1961).

A notre connaissance, la culture organotypique n’a pas encore été essayée sur les glandes génitales de Téléostéens. Quelques auteurs ont cultivé des ovaires de Poissons, mais par des méthodes de culture de cellules, dont la préparation et les buts sont très différents (Chen, 1970; Li & Stewart, 1965; Li & Jordan, 1969).

Nous pensons que les résultats qui pourraient être acquis à l’aide de la culture organotypique apporteront une contribution valable au problème de la différenciation sexuelle des Téléostéens, chez lesquels de nombreux points restent encore obscurs à l’heure actuelle.

Espèces choisies

Pour nos essais préliminaires (juillet à décembre 1970), nous avons choisi Carassius auratus, qui pouvait fournir des gonades mâles et femelles en repos sexuel ou en début de maturation, puisque la période de reproduction se situe au printemps ou au début de l’été. Dans les ovaires placés en culture, les ovocytes ne dépassaient pas le stade de début de vitellogenèse. Les lobules testiculaires présentaient toutes les étapes de la spermatogenèse, mais les cystes de spermatozoïdes étaient encore peu nombreux.

Ce poisson présente en outre un intérêt certain pour des expérimentations futures, car il n’est pas rare de rencontrer des individus présentant des caractères hermaphrodites, ce sont le plus souvent des ovocytes dans le testicule (Kino-shita, 1933; Stromstein, 1931; Atz, 1964). Ceci permet d’espérer une induction artificielle aisée d’une différenciation hétérotypique des cellules germinales.

En second lieu, Tilapia mariae, Cichlide dont la maturation sexuelle est pratiquement continue, nous a livré des ovaires dans lesquels se trouvaient des ovocytes jusqu’en fin de vitellogenèse, et des testicules dans lesquels les cystes de spermatozoïdes étaient fort nombreux.

Méthode de mise en culture

Les poissons, sous narcotisation par le MS-222 Sandoz, sont introduits dans la cabine de culture. La surface ventrale est nettoyée à l’alcool. Après l’ouverture de la cavité abdominale et l’écartement des viscères, les gonades sont disséquées et placées dans un premier bain de solution de Tyrode stérile.

Nous avons également prélevé des hypophyses. Le dessus de la tête est nettoyé à l’alcool, le toit du crâne est enlevé, et le cerveau délicatement ôté. Chez Tilapia, l’hypophyse, du type platybasilaire, reste accolée à l’hypothalamus, et elle est aspirée à l’aide d’une pipette sur la face ventrale du cerveau retourné. Chez Carassius, l’hypophyse, du type pédonculaire, est enfoncée dans le sphénoïde qu’il donc faut découper pour pipeter la glande. Les hypophyses sont placées dans un bain de solution de Tyrode stérile.

Les organes sont transférés ensuite dans un bain de Tyrode stérile contenant 1000 i.u. de sel de sodium de Pénicilline G et 0,5 mg de Streptomycine par ml de solution. Ils y séjournent 10-15 min, puis sont rincés dans deux nouveaux bains de solution de Tyrode stérile.

Une des gonades est fixée directement, et sera utilisée comme témoin. L’autre gonade est découpée en morceaux de taille adéquate pour la mise en culture : les testicules et les gonades femelles immatures sont découpés en tronçons; pour les ovaires en maturation, nous avons mis en culture des lobes ovariens isolés.

Composition du milieu

Nous inspirant de la technique élaborée par Wolff & Haffen (1952a, b), nous employons des salières contenant un milieu semi-solide dont la composition est la suivante : solution de Tyrode +1 % de glucose, 3 gouttes ; solution de Gey à double concentration + 2 % de glucose, 3 gouttes ; solution de Bacto-Agar à 2 % dans l’eau bidistillée, 3 gouttes; extrait d’embryon de Poulet de 9 jours, diluée à 50 % dans la solution de Tyrode, 3 gouttes ; 20 à 30 i.u. de sel de sodium de Pénicilline G dans 1 goutte d’eau bidistillée.

Incubation et repiquages

Les salières, lutées à la paraffine, sont placées dans un incubateur réglé à 22 °C. Lors de nos premières tentatives, nous avons remis les expiants sur un milieu frais après des délais de 7 jours. Par la suite, nous avons fait quelques essais pour espacer ces repiquages. Nous sommes parvenus à conserver des cultures, dont l’état sera décrit plus loin pendant 14 et 21 jours sur le même milieu, sans lavages ni ouverture des salières.

Techniques histologiques

Les expiants sont fixés par les liquides de Bouin et de Carnoy. La déshydratation, puis l’imprégnation par le butanol sont suivies d’enrobage à la paraffine. Les coupes de 6 à 9 μm sont colorées par le tri-chrome mixte de Masson, le tri-chrome de Cajal, et par la méthode à l’APS-hématoxyline de Groat-orange G (ou jaune naphtol S).

Généralités

Chez Carassius auratus, nous avons mis en culture 257 expiants d’ovaires et 14 expiants de testicules. Chez Tilapia mariae, nous avons cultivé 42 expiants d’ovaires et 33 expiants de testicules. Les expiants ont été fixés après 2 à 28 jours de culture.

Epithélialisation

Après quelques jours de culture, un épithélium de recouvrement se forme autour de l’explant. Il est principalement constitué de cellules somatiques conjonctives, mais des cellules germinales jeunes participent également à sa formation. L’édification de cet épithélium paraît plus rapide autour des expiants testiculaires qu’autour des expiants ovariens; ce fait pourrait s’expliquer par une modification plus aisée de la structure testiculaire, puisque les migrations cellulaires somatiques s’y effectuent sur de plus courtes distances.

Migration

Fréquemment, on peut observer une migration cellulaire plus ou moins abondante autour de l’explant. En plus d’un enfoncement de travées de tissu somatique à la base de l’explant, lui constituant une sorte d’enracinement dans le milieu, on peut voir souvent à sa périphérie une couronne de cellules dont la composition est assez variable. La plupart des cultures (d’ovaire surtout) laissent s’échapper des cellules d’apparence lymphocytaire ou phagocytaire, bourrées de déchets; d’autres éléments sont conjonctifs, d’autres germinaux. Parmi ces derniers, on retrouve les divers stades de différenciation: des cellules isolées ou parfois des cystes complets en spermatogenèse, entourés de quelques éléments somatiques sont situés en dehors de l’expiant testiculaire; de même, des ovogonies ou des ovocytes en stades prémeïotiques ou en prévitellogenèse peuvent migrer hors des cultures ovariennes.

Les migrations sont nettement favorisées par un retard dans la formation de l’épithélium de recouvrement. Elles peuvent être la cause, en dehors des dégénérescences, de l’absence ou de la forte diminution du nombre des cellules germinales dans les cultures de 28 jours.

Dégénérescence centrale

Dans les cultures de plus de 14 jours principalement (après 7 jours lorsque la taille des expiants était trop grande), nous avons observé parfois une dégénérescence centrale, qui atteint en premier lieu les cellules germinales plus évoluées que les gonies, quoique certains stades ultérieurs puissant persister longtemps intacts, puis les gonies, et ensuite le tissu conjonctif dont les fibres disparaissent et les noyaux entrent en pycnose. Sur le pourtour de cette zone apparaissent des cellules d’aspect phagocytaire, plus ou moins abondantes, qui semblent engloutir les déchets. Parfois un nouvel épithélium se forme à l’intérieur et isole la zone dégénérée.

Cette dégénérescence centrale ne paraît pas perturber l’activité de la zone corticale. De plus, dans le cas de cultures ovariennes, il nous semble plus indiqué de cultiver des expiants de taille assez grande (environ 2 mm de diamètre et 1 mm d’épaisseur), au risque d’obtenir une dégénérescence du centre ; en effet la périphérie intacte présente un aspect meilleur que celui de cultures de petite taille, où les traumatismes provenant du découpage lors de l’explantation et les remaniements internes lors des premiers jours sont beaucoup plus nocifs.

Evolution des éléments somatiques

Les érythrocytes et les éléments lymphocytaires persistent tout au long de la vie de la culture. Les seconds jouent un rôle actif d’élimination des déchets. Les cellules conjonctives s’hypertrophient légèrement; leur hyperplasie les rend souvent assez envahissantes, mais sauf évidemment dans les cas de dégénérescence centrale, elles restent saines.

Evolution des éléments germinaux

Les cellules germinales mâles conservent leur intégrité et leur pouvoir spermatogénétique jusqu’à 28 jours de culture. L’état de maturité de l’expiant lors du prélèvement joue cependant un grand rôle. Lors d’une série de cultures de testicules de Carassius auratus, alors que tous les stades de spermatogenèse étaient présents à l’origine, nous avons eu la surprise de constater qu’après 7 jours, tous les stades supérieurs à la transition spermatogonie-spermatocyte I avaient disparu, sauf quelques spermatozoïdes. Nous avons alors pensé à un arrêt de la spermatogenèse à ce stade, dû à une cause inconnue, peut-être l’absence de gonadotrophines. Par la suite cependant, nous avons observé dans une culture de 14 jours un cyste de spermatocytes I au stade de ‘bouquet’ (leptotène), ce qui montrait une capacité spermatogénétique encore intacte. Enfin, les cultures de testicules de Tilapia présentent, même après 21 et 28 jours, tous les stades de la spermatogenèse.

Si les étapes de la méiose se poursuivent, on peut également observer des mitoses de spermatogonies, au moins jusqu’à 21 jours, et surtout en périphérie de l’expiant.

Les cellules germinales femelles se conservent très bien jusqu’au stade d’ovocyte jeune, avant que le RNA n’envahisse le cytoplasme, et semblent garder leur capacité de différenciation, puisqu’on retrouve en culture des étapes de préméïose que l’on n’aperçoit que rarement chez les témoins (ce qui signifie que ces étapes s’effectuent rapidement). En prévitellogenèse, la conservation des ovocytes est capricieuse : certains restent intacts, d’autres dégénèrent rapidement. Les ovocytes en vitellogenèse débutante ou active ne sont conservés que dans certaines conditions. Les mitoses d’ovogonies sont rares.

L’atrésie des follicules ovariens se déroule suivant les schémas ordinaires (voir Beach, 1959, pour Carassius auratus’, Kraft & Peters, 1963, pour Tilapia’, Rastoghi, 1968; Shrivastava, 1969) et on trouve les stades suivants: éclatement du noyau et plissement de l’oolemme, hypertrophie de la granulosa et rupture de la membrane, phagocytose de l’ovocyte et sa résorption suivie du collapsus de la granulosa. Elle atteint, avec des modalités différentes selon la taille, des ovocytes en prévitellogenèse ou en vitellogenèse, les seconds le plus souvent, et les premiers dans une moindre proportion.

Influence de la durée de la culture

Cultures d’ovaires

A la fin de la première semaine, les expiants sont habituellement entourés d’un épithélium de recouvrement mince. La structure est conservée quasiintacte et l’expiant n’a pas encore acquis sa forme globuleuse. Le tissu somatique demeure dans un état de développement normal et les cellules germinales sont représentées à tous les stades ; on remarque cependant une plus grande fragilité des ovocytes en prévitellogenèse, dont le cytoplasme possède assez souvent un aspect anormalement craquelé.

Après 14 jours, l’épithélium s’est épaissi. C’est à ce moment aussi qu’on observe parfois des migrations hors de l’explant. L’explant acquiert une forme de sphère aplatie, régulière. Le tissu conjonctif est légèrement hyperplasié et hypertrophié, ses travées sont plus épaisses. On observe l’atrésie d’un nombre plus ou moins important d’ovocytes en prévitellogenèse ou en vitellogenèse (Fig. 1).

Fig. 1.

Carassius auratus: culture ovarienne de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Bouin, col. tri-chrome mixte de Masson.

Fig. 1.

Carassius auratus: culture ovarienne de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Bouin, col. tri-chrome mixte de Masson.

Après 21 jours, les tissus somatiques (conjonctif et phagocytes) occupent la plus grande surface des coupes. Les stades d’ovogenèse postérieurs à l’apparition de vacuoles périphériques (à inclusions glucidiques) sont tous atrésiés ou dégénérés. Les stades antérieurs subsistent plus ou moins intacts (Fig. 2).

Fig. 2.

Carassius auratus: culture ovarienne de 21 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G.

Fig. 2.

Carassius auratus: culture ovarienne de 21 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G.

Dans les expiants ovariens conservés jusqu’à 28 jours, nous n’avons pu retrouver d’autres cellules germinales que quelques ovogonies isolées, parmi le tissu somatique.

Cultures de testicules

A la fin de la première semaine, l’épithélium de recouvrement est formé. La structure testiculaire en lobules et cystes est parfaitement préservée, et la spermatogenèse est toujours très active, sauf chez Carassius (Fig. 3).

Fig. 3.

Carassius auratus: culture testiculaire de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Bouin, col. tri-chrome mixte de Masson. Seuls subsistent des spermatogonies (G) et quelques groupes de spermatozoïdes (Z).

Fig. 3.

Carassius auratus: culture testiculaire de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Bouin, col. tri-chrome mixte de Masson. Seuls subsistent des spermatogonies (G) et quelques groupes de spermatozoïdes (Z).

A la fin de la seconde semaine, malgré un envahissement progressif du tissu somatique, la structure générale reste nette, et les diverses étapes de la spermatogenèse se retrouvent.

Après 21 jours, l’expansion somatique est encore plus forte et les lobules testiculaires sont déformés. La spermatogenèse paraît diminuer d’activité (Fig. 4).

Fig. 4.

Tilapia mariae: culture testiculaire de 21 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. Tous les stades de la spermatogenèse peuvent se retrouver: spermatogonies (G), spermatocytes (C), spermatides (T), spermatozoïdes (Z).

Fig. 4.

Tilapia mariae: culture testiculaire de 21 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. Tous les stades de la spermatogenèse peuvent se retrouver: spermatogonies (G), spermatocytes (C), spermatides (T), spermatozoïdes (Z).

Après 28 jours, seule la périphérie contient encore des cystes de cellules germinales, beaucoup moins actives que précédement : prédominance de spermatogonies et de spermatides-spermatozoïdes (Fig. 5).

Fig. 5.

Tilapia mariae. culture testiculaire de 28 jours. 2 repiquages après 7 et 14 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. L’activité spermatogénétique paraît s’épuiser.

Fig. 5.

Tilapia mariae. culture testiculaire de 28 jours. 2 repiquages après 7 et 14 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. L’activité spermatogénétique paraît s’épuiser.

Influence de la maturité de lexplant lors du prélèvement

Cultures d’ovaires

Par l’examen des ovaires-témoins de Carassius auratus, nous avons constaté que les fragments de glandes génitales mis en culture se trouvaient à l’origine en des stades divers de maturation. Quelques données sur la maturation des ovocytes de Carassius peuvent être lues chez Mendoza (1954), Beach (1959), Yamamoto & Yamazaki (1961).

La proportion d’ovogonies et d’ovocytes en stades préméïotiques, par rapport au nombre total de cellules germinales, constitue un premier indice pour l’examen des cultures. En recherchant de nouveau cette proportion après 1, 2 et 3 semaines de culture, nous pouvons dire que la multiplication mitotique des ovogonies est faible : les expiants qui, à l’origine, contenaient un grand nombre de ces cellules en mitose, montrent encore par la suite une proportion importante de cellules à ce stade, les expiants pauvres en ovogonies lors du prélèvement, en demeurent peu pourvus. La même observation peut être faite par l’examen des stades préméïotiques: leur nombre dépend de leur quantité à l’origine, et il diminue lorsque la durée de la culture augmente. Ces stades perdurent donc, mais ne semblent pas être suffisamment renouvelés par l’entrée en méiose caractérisant le passage d’ovogonie à ovocyte.

La détermination des stades ovogénétiques effectivement atteints chez les témoins constitue un second indice : l’ovogenèse est arrêtée, selon les ovaires, (I°) au stade d’ovocyte à cytoplasme fortement basophile, avec une extension du noyau vitellin jusqu’à la formation d’une structure annulaire subpériphérique, (2°) au stade de vitellogenèse débutante, révélée par l’apparition de quelques vacuoles au sein de l’anneau décrit ci-dessus, (3°) au stade de vitellogenèse plus avancée, révélée par la présence de vacuoles à contenu glucidique, et l’apparition de la zona radiata, encore réduite à une mince membrane, surmontant une striation du cytoplasme sous-jacent. Plus l’ovocyte est différencié, plus il paraît enclin à dégénérer. Dans des conditions normales et pour des durées plus longues que deux semaines, on ne trouve plus d’ovocytes en vitellogenèse, et leur mode habituel de dégénérescence est l’atrésie. Le nombre de corpora atretica sera donc d’autant plus grand dans l’expiant que l’ovaire était plus mûr à l’origine. Cet envahissement somatique, encore plus prononcé chez Tilapia, est défavorable à l’ovogenèse.

Les ovaires de Tilapia mariae que nous avons placés en culture contenaient des ovocytes dont les plus différenciés l’étaient soit jusqu’à la phase II (en prévitellogenèse, basophiles avec extension du noyau vitellin) - cet état correspond aux ovaires les plus évolués de Carassius - soit jusqu’à la phase V (en vitellogenèse avancée, cytoplasme bourré de vitellus, noyau excentrique, zona radiata bien développée), c’est-à-dire en pleine maturation. Une description très détaillée de l’ovogenèse chez le genre Tilapia a été faite par Kraft & Peters (1963).

Dans les expiants mis en culture, et dont les ovocytes ne dépassent pas la phase II, l’aspect est comparable à celui que l’on a observé chez Carassius. Dans les expiants plus mûrs, il est très différent. En l’absence de parabiose avec l’hypophyse, les membranes des ovocytes riches en vitellus se fragmentent, le contenu se répand, le nombre d’éléments somatiques responsables de l’élimination des déchets (cellules de la granulosa et phagocytes) augmente rapidement. La proportion de cellules germinales subsistant après 14 jours est donc faible.

Cultures de testicules

Les testicules de Carassius auratus contenaient à l’origine tous les stades de la spermatogenèse, à peu près également représentés. Ceux de Tilapia mariae étaient plus mûrs : le nombre de spermatozoïdes était proportionnellement plus important. (Dadzie (1969) et Hyder (1969, 1970) donnent les descriptions de la spermatogenèse chez quelques Tilapia.)

Nous avons déjà signalé la conséquence imprévue de l’état de maturation chez Carassius: les cultures de testicules, après 7 jours seulement, révèlent une inhibition quasi-totale des stades intermédiaires de la spermatogenèse. Par contre, la spermatogenèse se poursuit dans les testicules de Tilapia jusqu’à 28 jours de culture. L’état de maturation semble donc présenter une incidence nette sur l’aspect de la culture. Des expériences ultérieures seront nécessaires pour en déterminer exactement la cause.

Influence de la quantité d’extrait d’embryon de Poulet présente dans le milieu de culture

Dans une série de cultures ovariennes de Carassius, nous avons diminué des 2/3 la quantité d’extrait d’embryon de Poulet (1 goutte au lieu de 3 gouttes, par salière). La comparaison de 32 expiants cultivés sur le milieu contenant 3 gouttes, avec 19 expiants cultivés sur un milieu contenant 1 goutte, ne permet pas d’affirmer que la diminution de matière nutritive disponible ait un effet nettement nocif. Les expiants ont été prélevés après 7, 9, 12 et 14 jours. La seule différence observée est une plus grande perte de basophilie, une plus grande irrégularité de contours et l’apparition de vacuoles anormales chez une partie des ovocytes en prévitellogenèse dans les cultures sur milieu pauvre par rapport à celles sur milieu riche.

Nous avions tenté cet essai afin de diminuer la migration cellulaire de hors de l’expiant. Cette migration n’a pas été inhibée. Puisque nous désirions par la suite cultiver pendant des périodes plus longues que 7 jours sans repiquage, nous avons définitivement adopté la concentration de 3 gouttes d’extrait d’embryon de Poulet par salière.

Influence du repiquage

Le placement de la culture sur un milieu frais tous les 7 jours ne semble pas indispensable. On ne remarque que peu de différences entre des expiants non repiqués et repiqués après 7 jours, lorsqu’on les examine après 2 semaines de culture. Nous avons pu également conserver deux expiants jusqu’à 21 jours sans aucun repiquage : leur état reste comparable à celui des fragments repiqués 1 ou 2 fois pendant cet intervalle.

De plus, le remplacement précoce du milieu pourrait, par suite des inévitables manipulations à faire subir aux expiants, être la cause de défauts dans l’édification de l’épithelium de recouvrement qui protégera la culture. Nous avons en effet remarqué que les cultures non repiquées après 7 jours possèdent toutes un épithélium bien formé, alors que certaines autres montrent des irrégu-larités. Le remaniement interne des structures, par suite du déplacement paraît troubler plus l’organisation originale de l’explant. Ceci est surtout remarquable dans les testicules.

Les migrations cellulaires, somatiques et germinales, sont moins prononcées lorsqu’on n’effectue pas de repiquages. La cause semble en être la meilleure cohésion de l’épithelium de recouvrement plutôt qu’une diminution de l’activité cellulaire, puisque l’état des éléments somatiques et germinaux est identique après que l’on ait remplacé ou non le milieu (Figs. 6, 7).

Fig. 6.

Carassius auratus : culture ovarienne de 14 jours, non repiquée. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G.

Fig. 6.

Carassius auratus : culture ovarienne de 14 jours, non repiquée. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G.

Fig. 7.

Carassius auratus : culture ovarienne de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. Cet expiant provient du même ovaire que celui de la Fig. 6, et a donc été traité dans les mêmes conditions, à part le repiquage.

Fig. 7.

Carassius auratus : culture ovarienne de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. Cet expiant provient du même ovaire que celui de la Fig. 6, et a donc été traité dans les mêmes conditions, à part le repiquage.

Premiers essais de parabiose

Les remarques ci-après ont un caractère tout-à-fait provisoire et indiquent une possibilité d’association plutôt qu’elles ne fournissent des résultats.

Association d’ovaire avec Vhypophyse

Nous avons associé 3 expiants ovariens de Carassius et 4 de Tilapia aux hypophyses des poissons donneurs; 2 autres expiants du même individu se trouvaient dans la même salière. Quelques autres salières contenant d’autres fragments servirent de témoins. La durée de l’expérimentation a été de 5, 9, 14 (3 fois) et 21 (2 fois) jours. (Des cultures organotypiques d’hypophyses de poissons ont déjà réalisées: Baker (1963) cher la Truite, Sage (1965, 1968a, b), Sage & Bromage (1970) chez Xiphophorus, Poecilia.)

La fusion de l’hypophyse avec le fragment ovarien est déjà complètement réalisée après 5 jours, et elle se modifie légèrement par la suite, soit avec l’étalement de l’hypophyse sur l’ovaire, soit avec sa pénétration progressive au sein de l’ovaire.

L’effet de cette association paraît dès à présent assez significatif: l’explant accolé à hypophyse possède un meilleur aspect général lorsqu’on le compare à tous les autres, qui ont été élevés dans des conditions identiques. Nous remarquerons que c’est seulement lorsque l’hypophyse est en parabiose que l’on conserve après 14 jours une zona radiata intacte, donc, un ovocyte en vitellogenèse avancée gardant son intégrité. Les deux expiants accompagnant l’association sont dans un état de conservation intermédiaire entre cette dernière et les expiants d’autres salières : la proportion d’ovocytes en vitellogenèse est nettement plus grande que dans les expiants cultivés sans la présence d’hypophyse dans la salière ; en conséquence directe, le nombre de corpora atretica est réduit d’autant (Figs. 8 –10).

Fig. 8.

Tilapia marias: parabiose de l’ovaire avec l’hypophyse (H), 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. La zona radiata de l’ovocyte en phase V demeure intacte.

Fig. 8.

Tilapia marias: parabiose de l’ovaire avec l’hypophyse (H), 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. La zona radiata de l’ovocyte en phase V demeure intacte.

Fig. 9.

Tilapia mariae : culture ovarienne de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. L’explant provient du même ovaire que celui de la Fig. 8. Un ovocyte en phase V était également présent. Il est totalement dégénéré (Ov).

Fig. 9.

Tilapia mariae : culture ovarienne de 14 jours, 1 repiquage après 7 jours. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. L’explant provient du même ovaire que celui de la Fig. 8. Un ovocyte en phase V était également présent. Il est totalement dégénéré (Ov).

Fig. 10.

Carassius auratus: parabiose de l’ovaire avec l’hypophyse (H). 14 jours, sans repiquage. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. Des ovocytes en vitellogenèse se retrouvent en assez grand nombre. Comparer avec la Fig. 6: cet expiant provenait du même ovaire que celui-ci, et a subi le même traitement, mis à part l’association avec l’hypophyse. Comparer également avec la Fig. 7.

Fig. 10.

Carassius auratus: parabiose de l’ovaire avec l’hypophyse (H). 14 jours, sans repiquage. Fix. Carnoy, col. APS-hématoxyline de Groat-orange G. Des ovocytes en vitellogenèse se retrouvent en assez grand nombre. Comparer avec la Fig. 6: cet expiant provenait du même ovaire que celui-ci, et a subi le même traitement, mis à part l’association avec l’hypophyse. Comparer également avec la Fig. 7.

On peut concevoir la présence d’hormones (gonadotropes vraisemblablement) diffusible jusque dans le milieu de culture, pour expliquer l’état très different de ces expiants par rapport aux témoins. Ceci sera vérifié lors d’expérimentations futures.

Association d’ovaire et de testicule

Nous avons associé par deux fois des expiants ovariens et testiculaires chez Carassius; ils furent fixés après 7 jours. Nous avons répété 5 fois cette association chez Tilapia; la fixation a été pratiquée après 21 jours.

La fusion entre les deux fragments est réalisée après 7 jours, et les mouvements d’étalement ou d’enfoncement du testicule dans l’ovaire se voient après 21 jours. Les tissus somatiques des deux glandes sont intimement interpénétrés le long de la suture, et ils ont entraîné les cellules germinales, si bien que l’on peut observer des ovocytes et des éléments de la spermatogenèse côte à côte dans cette région.

Vu le nombre restreint de ce type de parabiose, nous ne pouvons pas encore déceler une éventuelle interaction. Nous espérons apporter, par des essais futurs, des précisions sur ce type d’association.

La culture organotypique de glandes génitales de Téléostéens se révèle aisément réalisable dans les conditions techniques que nous avons employées, à savoir en salières, sur milieu gélosé contenant du glucose et de l’extrait d’embryon de Poulet comme substrat nutritif. Les cellules germinales conservent une capacité de différenciation plus ou moins intacte jusqu’à trois semaines de traitement environ. Par la suite, leur activité paraît fortement réduite (testicules) ou anihilée (ovaires).

On remarque une nette différence entre le comportement des cellules somatiques et des cellules germinales. Si les cellules somatiques subissent peu de modifications, mis à part une hyperplasie et une légère hypertrophie, les cellules germinales au contraire, présentent une dégénérescence progressive, atteignant tout d’abord les stades les plus évolués. Des adjonctions, dans le milieu de culture, de produits hormonaux et autres permettront peut-être de déceler quelles substances offrent aux cellules germinales un développement aussi satisfaisant que celui des cellules somatiques.

L’état de maturation de l’expiant lors du prélèvement joue un rôle non négligeable sur l’évolution future de la culture. Dans le cas des expiants ovariens, il semble préférable d’employer des ovaires qui ne soient pas dans un état de maturation avancée: ceux dont les ovocytes ne dépassent pas le stade de début de vitellogenèse se comportent nettement mieux en culture. Par contre, dans le cas des expiants testiculaires, les essais que nous avons effectués semblent montrer qu’il est avantageux d’utiliser des testicules dans lesquels la spermatogenèse est active et le nombre de spermatozoïdes important.

Le problème de la fréquence des repiquages est plus difficile à résoudre. Nous admettons qu’en théorie, un remplacement fréquent du milieu ne saurait être que bénéfique, mais les résultats de nos essais d’espacement des repiquages semblent plaider en faveur d’une intervention moins souvent répétée pendant la période de culture. La meilleure cohésion de l’épithélium de recouvrement, la diminution des migrations cellulaires hors de l’expiant et des troubles causés par les remaniements internes lorsqu’il n’y a pas eu de repiquage après 7 jours, nous feront vraisemblablement adopter des délais plus longs pour nos expérimentations futures.

Les glandes génitales de Téléostéens en culture organotypique, nous paraissent un excellent matériel pour l’analyse d’influences hormonales. Les divers stades de différenciation des cellules germinale, qui se conservent relativement bien en culture et sont facilement repérables, constituent de bons indices pour la mise en évidence des effets de substances ou de parabioses, telles que des association avec l’hypophyse, dont nous avons déjà tenté quelques essais prometeurs.

La culture organotypique des glandes génitales de Téléostéens, sur milieu gélosé, contenant du glucose et de l’extrait d’embryon de Poulet, permet une conservation de l’activité des cellules germinales jusqu’à 21 jours au moins. L’influence de l’état de maturation de l’expiant lors du prélèvement, de la quantité de matières nutritives disponible et du repiquage est analysée. Pour une meilleure conservation des expiants, il semble profitable d’employer des ovaires dans lesquels les ovocytes ne dépassent pas le stade de vitellogenèse débutante et des testicules en spermatogenèse active, dans lesquels les spermatozoïdes sont déjà nombreux. De même, l’espacement des repiquages paraît indiqué.

Quelques essais de paraboises avec l’hypophyse ou avec des glandes génitales du sexe opposé ont été réalisés.

L’un de nous (C.R.) est un aspirant au F.N.R.S.

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