On sait que Forganogenèse pulmonaire (Dameron, 1961a, b) s’effectue seulement lorsque les deux constituants de l’ébauche, épithélium bronchique et mésenchyme pulmonaire, sont associés. Les interactions qui s’exercent entre les deux tissus sont indispensables pour la croissance et la différenciation de l’épithélium.

Nous avons cherché à préciser la nature de ces interactions. Le mésenchyme maintient l’intégrité de l’épithélium auquel il sert de tissu de soutien. Son rôle est-il simplement physique? ou bien son action est-elle véritablement inductrice et s’exerce-t-elle grâce à l’élaboration de substances morphogènes comme il en existe dans de nombreux types d’induction ?

Nous nous sommes également demandée quelle était la spécificité de ces interactions. La différenciation de l’épithélium bronchique s’effectue-t-elle seulement sous l’influence du mésenchyme pulmonaire? Ou bien la présence d’un tissu mésenchymateux quelconque est-elle suffisante pour permettre l’évolution normale de la bronche?

Pour déterminer la nature et la spécificité des interactions entre l’épithélium et le mésenchyme, nous avons cultivé la bronche dans différentes conditions expérimentales :

— séparée du mésenchyme pulmonaire par une membrane filtrante;

— associée à des mésenchymes soit de natures très diverses soit d’une autre classe zoologique.

1. Matériel

Nous avons étudié la morphogenèse du poumon chez l’embryon de Poulet de la race Leghorn blanche (Gallus gallus). Le mésenchyme pulmonaire de Souris associé à la bronche de Poulet provient de la race Swiss,

2. Méthodes

(a) Méthode de culture organotypique in vitro

Nous utilisons la méthode de culture in vitro en milieu naturel mise au point par Wolff & Haffen (1952). Le milieu standard est enrichi par du serum (Wolff & Wolff, 1952). En voici la composition: gélose à 1 % dans du liquide de Gey, 6 gttes; extrait embryonnaire dilué de moitié dans du liquide de Tyrode, 3 gttes; liquide de Tyrode, I gtte; serum de Poulain (Difco), 3 gttes. Le liquide de Tyrode contient de la pénicilline G (sel de Na) en solution dans le ‘Subtosan’ Spécia à raison de 10 unités Oxford par milieu de culture.

Les expiants, prélevés à 5 jours d’incubation à l’aide de la loupe binoculaire, sont déposés sur un milieu de culture préalablement recouvert d’un fragment de membrane vitelline (Wolff, 1960). Cette dernière favorise l’étalement des expiants et améliore les conditions de culture.

(b) Méthode de greffe in ovo

Dans les associations de bronches avec des mésenchymes hétérologues, une partie des expiants a été greffée après une courte période de culture: bronche et mésenchyme sont associés sur un milieu où ils sont laissés pendant 18 h afin qu’ils se soudent en un expiant unique. L’expiant est alors introduit dans la cavité cœlomique d’un embryon receveur de 3 jours d’incubation. Très vite irrigué, le greffon se développe rapidement sans contact direct avec les autres organes. Nous avons également fait quelques greffes sur la membrane chorioallantoïdienne d’embryons de 7 jours.

(c) Technique de séparation des tissus embryonnaires

La bronche est séparée de son manchon mésenchymal à l’aide de la trypsine selon une technique dérivée de celle de Moscona (1952). Les poumons sont plongés pendant 11 min dans une solution de trypsine à 1 %, à la température de la glace fondante. Nous utilisons la trypsine cristallisée Worthington dissoute dans une solution de Earle sans calcium ni magnésium, mais additionnée de pangestine à la concentration de 1 %. La pangestine évite la production de mucus par les cellules. Une dissociation mécanique à l’aide d’aiguilles montées très fines est ensuite nécessaire pour compléter la séparation des tissus. La bronche enfin isolée est seule conservée. Nous la rinçons dans un mélange à parties égales de solution de Tyrode et de serum de poulain pour éliminer l’excès de trypsine, puis dans une solution de Tyrode pure.

Le mésenchyme pulmonaire utilisé dans les réassociations est prélevé par microdissection, sans trypsination. On le découpe autour de la bronche à l’aide de scalpels fins, en prenant bien soin de ne pas entraîner d’épithélium.

(d) Techniques histologiques

En vue de leur étude histologique, la plupart des expiants ont été fixés en fin d’expérience au liquide de Bouin. Coupés à une épaisseur de 5 μ, ils ont été colorés soit à l’hémalun et au Gabe (Gabe & Martoja-Pierson, 1957), soit au Mallory. D’autres, fixés au liquide de Gendre, ont été colorés au réactif de Schiff (technique de Hotchkiss-MacManus).

L’interposition de membranes filtrantes entre deux tissus réagissants a déjà permis de mettre en évidence des systèmes inducteurs où le contact tissulaire est nécessaire pour que s’effectue la morphogenèse (Lash, Holtzer & Holtzer, 1957) et d’autres où interviennent des substances inductrices diffusibles (Grobstein, 19532b; Auerbach, 1960). Ces résultats ont été obtenus à l’aide des filtres Millipores. Par contre, il n’a pas été signalé d’activité morphogène à travers la membrane vitelline de l’œuf de poule, la cellophane et le papier à cigarette (Holtfreter, 1933; Brachet, 1950; Moore, 1952). “

Pour connaitre le mode d’action du mésenchyme pulmonaire, nous avons comparé l’évolution de l’épithélium lorsqu’il est cultivé au contact direct de son inducteur à son évolution lorsque les deux tissus sont séparés par une membrane filtrante. Nous avons utilisé trois types de membrane, la membrane vitelline de l’œuf de poule, la membrane de cellophane et les membranes Millipores.

Quel que soit le type de membrane utilisé, nous la découpons en petits fragments. Au moment de la mise en culture, nous déposons le mésenchyme pulmonaire sur le milieu de culture et le recouvrons de la membrane filtrante. La bronche est placée sur le filtre juste au-dessus du mésenchyme (ou inversement) comme le montre la figure 1. Les bronches controlatérales servant de témoins sont cultivées sur la membrane vitelline, soit seules, soit en association directe avec le mésenchyme pulmonaire.

Fig. 1.

Schéma illustrant la technique de culture avec interposition de membrane filtrante. Le mésenchyme, déposé sur le milieu de culture, est recouvert de la membrane. L’épithélium est placé sur celle-ci, juste au-dessus du mésenchyme. Br., épithélium bronchique; Mes., mésenchyme pulmonaire; Mb. Vit., membrane vitelline.

Fig. 1.

Schéma illustrant la technique de culture avec interposition de membrane filtrante. Le mésenchyme, déposé sur le milieu de culture, est recouvert de la membrane. L’épithélium est placé sur celle-ci, juste au-dessus du mésenchyme. Br., épithélium bronchique; Mes., mésenchyme pulmonaire; Mb. Vit., membrane vitelline.

1. Résultats: évolution de la bronche séparée du mésenchyme pulmonaire par une membrane filtrante

(a) Membrane vitelline de l’œuf de Poule

La membrane vitelline de l’œuf de Poule non incubé constitue un filtre anhyste, de faible épaisseur (6 à 10 μ). Nous l’avons interposée entre épithélium et mésenchyme pulmonaires dans 21 cas.

Treize bronches ont conservé leur structure tubulaire. De plus, elles ont développé quelques digitations. L’épithélium est sain, d’aspect palissadique; il a proliféré (planche 1, fig. 2).

Les 8 autres bronches se sont plus ou moins étalées sur la membrane vitelline. L’épithélium, de type palissadique, a formé cependant un certain nombre de replis qui marquent une tendance à la tubulisation et indiquent une prolifération épithéliale assez importante. Il est important de signaler que nous n’avons jamais observé de régressions analogues à celles obtenues avec les bronches controlatérales cultivées seules. La figure (planche 1, fig. 3) est une illustration de ce type d’évolution. Les quelques fibroblastes que l’on peut observer sur le bord de la membrane vitelline proviennent soit de cellules épithéliales dédifférenciées, soit de cellules mésenchymateuses qui n’ont pas été éliminées par la trypsine. Mais même si ces fibroblastes sont d’origine mésenchymateuse, leur trop petit nombre ne leur permet pas d’induire la différenciation de l’épithélium: les bronches témoins cultivées isolément se dédifférencient dans tous les cas.

Dans l’ensemble, la bronche, séparée du mésenchyme pulmonaire par une membrane vitelline, est donc capable d’opérer une certaine morphogenèse. Cette morphogenèse rappelle celle que l’on obtient lorsque les deux tissus sont cultivés en contact direct. Elle est toutefois plus faible et d’aspect légèrement différent: la structure bronchique est moins caractéristique et les digitations moins nombreuses. On peut conclure néanmoins, qu’à travers la membrane vitelline, diffuse une substance permettant l’organisation de l’épithélium bronchique, sa prolifération et sa ramification.

(b) Membrane de cellophane

Sur les 15 bronches séparées du mésenchyme pulmonaire par un membrane de cellophane, nous n’avons pas observé la moindre différenciation. Les bronches régressent et se nécrosent. Elles évoluent comme les bronches témoins cultivées isolément.

(c) Membranes Millipores

Quatre types de filtres ont été essayés (VF, VM, PH et TH). Différant par leur épaisseur et la dimension de leurs pores, ces membranes pourraient nous renseigner sur la taille des molécules constituant l’agent inducteur et la distance limite entre les deux ébauches pulmonaires permettant encore l’induction.

Le tableau 1 indique le nombre de bronches expérimentées dans chaque catégorie de filtre et leur type d’évolution.

Tableau 1.

Evolution de la bronche séparée du mésenchyme pulmonaire par une membrane Millipore

Evolution de la bronche séparée du mésenchyme pulmonaire par une membrane Millipore
Evolution de la bronche séparée du mésenchyme pulmonaire par une membrane Millipore

Les filtres VF et VM aux pores les plus fins (0,01 et 0,05 μ) et relativement épais (150 μ), ne permettent pas la morphogenèse du bourgeon pulmonaire. Après 5 jours de culture, l’épithélium est entièrement étalé sur le filtre; sa nécrose est fréquente. Le type PH, dont les pores sont beaucoup plus larges (0,3 μ), s’est montré à peine plus favorable que les précédents: la bronche s’est aussi complètement étalée mais l’épithélium est resté sain et palissadique comme on le voit sur la figure (planche 1, fig. 4). Enfin, le type TH, moins épais que les 3 autres filtres (épaisseur de 25 μ et diamètre des pores de 0,45 μ) donne des résultats comparables à ceux que l’on obtient avec le filtre PH. L’épithélium survit mais on n’observe ni différenciation ni structures caractéristiques. La figure (planche 1, fig. 5) nous montre l’évolution d’une bronche cultivée sur un filtre TH.

Les bronches sont donc capables de survivre sur les filtres Millipores PH et TH mais non d’effectuer leur morphogenèse.

2. Conclusions

Ces expériences montrent que le mésenchyme pulmonaire peut exercer son action à travers certains types de filtres. On peut donc penser que, comme dans d’autres systèmes embryonnaires, le poumon s’édifie, au moins en partie, sous l’influence d’une ou des substances inductrices élaborées par le mésenchyme. Ces substances diffusent vers l’épithélium pour en déclencher la différenciation.

— Elles sont capables de filtrer à travers la membrane vitelline. Nous obtenons dans ce cas différents degrés d’évolution: ces substances peuvent diffuser plus ou moins bien, en particulier s’il est resté de l’albumine sur la membrane vitelline.

— Leur influence ne se manifeste pas ou se manifeste très peu à travers les filtres Millipores. Il est probable que la quantité de facteurs morphogènes qui parvient à traverser les filtres PH et TH est trop faible pour induire l’évolution de l’épithélium bronchique. En outre, cette évolution peut être gênée en raison de l’étalement de l’épithélium très accusé sur ces filtres cellulosiques.

En conclusion, la morphogenèse de la bronche peut s’effectuer en dehors de tout contact direct avec le mésenchyme, pourvu que les substances morpho-gènes qu’il élabore puissent atteindre l’épithélium.

Des associations hétérologues d’ébauches épithéliales et mésenchymateuses ont été pratiquées par un certain nombre d’auteurs. Elles ont apporté de nombreux renseignements sur le problème de la spécificité de deux tissus l’un par rapport à l’autre dans un système inducteur. El lies ont montré, en particulier, que la réponse du tissu compétent à l’inducteur hétérologue est variable. Selon l’organe considéré :

— ou bien l’effecteur continue à évoluer selon sa propre nature, quelquefois avec un certain retard (c’est le cas du mésenchyme métanéphrique, Grobstein, 1955; de l’épithélium thymique, Auerbach, 1960; de l’endoderme hépatique, Le Douarin, 1964).

— ou bien l’effecteur est incompétent envers l’inducteur et reste indifférencié : comme, par exemple, l’épithélium salivaire (Grobstein, 1953a), l’épithélium urétéral de Souris (Grobstein, 1955).

— ou bien, enfin, la différenciation de l’effecteur subit l’influence de l’inducteur hétérologue: c’est le cas de l’épiderme (MacLoughlin, 1961), de l’épithélium pancréatique (Golosow & Grobstein, 1962), de l’épithélium de pro ventricule (Sigot, 1963), de l’épithélium urétéral de Poulet (Calame-Bishop, 1966).

En ce qui concerne le poumon, il est donc intéressant de savoir si la bronche peut poursuivre son évolution au contact d’un mésenchyme hétérologue. Dans ce cas, sa différenciation sera-t-elle conforme à sa destinée propre d’arbre bronchial ? Sera-t-elle modifiée en fonction de la nature du mésenchyme associé?

Nous avons éprouvé l’influence de mésenchymes très divers par leur origine, leur nature et leur situation (Dameron, 1961a, b, 1966):

— des mésenchymes spécialisés, de même parenté embryologique que le mésenchyme pulmonaire, tels que les mésenchymes du tube digestif (proventricule, gésier, intestin, foie).

— des mésenchymes spécialisés venant d’organes quelconques très différents, comme la peau, le métanéphros, le mésonéphros, la tête et l’allantoïde.

— un mésenchyme très jeune, le mésenchyme somitique.

— un mésenchyme xénoplastique provenant d’une autre classe zoologique : le mésenchyme pulmonaire de Souris.

Enfin, nous nous sommes demandée si, comme le mésenchyme pulmonaire, les mésenchymes hétérologues agissaient par l’intermédiaire d’une substance diffusible. Nous avons donc, dans certains cas, cultivé le mésenchyme hétérologue et la bronche de part et d’autre d’une membrane vitelline.

A. Techniques utilisées

1. Préparations des ébauches mésenchymales

— Nous prélevons la plupart des mésenchymes hétérologues par microdissection à l’aide de scalpels extrêmement fins, sans trypsination. Des cultures contrôles nous permettent de vérifier si nous n’avons pas entraîné par mégarde de l’épithélium avec ces mésenchymes.

— Dans le cas du derme, prélevé à 6,5 jours d’incubation, un passage à la trypsine est nécessaire pour bien décoller l’épiderme (traitement de 15 min dans la trypsine).

— Pour isoler le mésenchyme mésonéphrique, on doit recourir à la technique utilisée par Calame-Bishop (1961, 1966). Sur un embryon de 15 à 25 somites, on arrête, par un obstacle ou une excision (figure 6A), la progression en arrière du canal de Wolff, inducteur normal du mésonéphros. On empêche ainsi l’induction du mésenchyme mésonéphrique et sa différenciation en tubules. On greffe alors la bronche à une distance de quelques somites présomptifs, caudalement par rapport à l’obstacle ou à l’excision, dans le territoire du mésenchyme mésonéphrique.

Fig. 6.

A: Technique de greffe d’une bronche dans le territoire mésonéphrogène. Opération sur un embryon de 15 à 25 somites (d’après Calame-Bishop, 1961, 1966). B; Technique qui permet d’isoler le mésenchyme hépatique. Opération sur un embryon de 9 à 15 somites (d’après Le Dourain.l 964). br., bronche ; més.méso., territoire du mésenchyme mésonéphrique; z.exc., zone excisée; z.f., zone du foie; z.m.h., zone du mésenchyme hépatique.

Fig. 6.

A: Technique de greffe d’une bronche dans le territoire mésonéphrogène. Opération sur un embryon de 15 à 25 somites (d’après Calame-Bishop, 1961, 1966). B; Technique qui permet d’isoler le mésenchyme hépatique. Opération sur un embryon de 9 à 15 somites (d’après Le Dourain.l 964). br., bronche ; més.méso., territoire du mésenchyme mésonéphrique; z.exc., zone excisée; z.f., zone du foie; z.m.h., zone du mésenchyme hépatique.

— Pour empêcher la colonisation du mésenchyme hépatique par les cordons hépatiques, nous nous sommes rapportée à la technique de Le Douarin (1964). Aux stades de 9 à 15 somites, on excise une bande transversale sur une longeur de 3 à 4 somites, depuis l’axe somitique jusqu’à l’aire opaque, entre le 3ème et le 6ème somites (figure 6B). Au 5 ou 6ème jours d’incubation, ce mésenchyme hépatique forme un petit lobe globulaire rose foncé, accolé au tube digestif resté ouvert depuis le niveau de l’excision jusqu’à l’ombilic intestinal. Nous avons prélevé le mésenchyme à ce moment pour l’associer à la bronche en culture.

2. Culture des ébauches réassociées

L’évolution des associations hétérologues est étudiée dans deux situations différentes:

— en culture in vitro prolongée (pendant 5 à 7 jours);

— en culture de courte durée (pendant 18 h) suivie de greffe (pendant 4 à

6 jours). Ceci permet d’obtenir un développement plus important des expiants.

Les résultats fournis par ces associations sont comparés à l’évolution des bronches controlatérales isolées ou réassociées au mésenchyme pulmonaire.

Nous considérons comme favorables les mesenchymes qui permettent l’évolution de la bronche, c’est-à-dire:

— la prolifération de l’épithélium entraînant la ramification ou, à défaut, la formation de replis de la paroi bronchique;

— la différenciation histologique de l’épithélium.

Nous qualifions de non inducteurs les mésenchymes qui provoquent la résorption de la bronche ou un ballonnement excessif, accompagné de dégénérescence de l’épithélium.

B. Résultats

I. Influence du mesenchyme pulmonaire sur la morphogenèse de la bronche

En ce qui concerne l’évolution des témoins, nous savons déjà que la bronche réassociée au mésenchyme pulmonaire en culture in vitro (Dameron, 1961 a, b, 1966) effectue une bonne morphogenèse.

Lorsqu’une association analogue est greffée après 18 h de culture, le greffon se vascularisé rapidement et acquiert très vite une taille importante. La bronche se ramifie abondamment. Les divers ordres de bronches se trouvent le plus souvent représentés (planche 2, fig. 7). La croissance équivaut approximativement à cell d’un poumon développé dans les conditions naturelles mais dont le plan morphologique est atypique.

2. Influence des mésenchymes de même parenté embryologique que le mésenchyme pulmonaire

(a) Mésenchymes du proventricule, du gésier et de l’intestin

Vingt-sept bronches ont été associées au mésenchyme de proventricule, 26 au mésenchyme de gésier et 42 au mésenchyme intestinal. Parmi celles-ci, 27, 19 et 40 ont respectivement évolué. Ces expériences ont été faites soit en culture, soit en culture suivie de greffe.

L’observation histologique montre que l’épithélium et le mésenchyme mis en présence s’associent étroitement et réagissent l’un par rapport à l’autre (planche 2, fig. 8, 9). Les mésenchymes différencient une double ceinture musculaire autour de la bronche. A l’intérieur de celle-ci, le bourgeon pulmonaire dessine des replis ou villosités. Il prend l’aspect d’une muqueuse pluristratifiée, surtout au contact des mésenchymes de proventricule et de gésier.

Ainsi ces expiants ou ces greffons ont l’allure d’un tube digestif: la transformation de la bronche peut être due soit à des raisons mécaniques, les nappes musculaires qui enveloppent la bronche gênant son évolution, soit à l’influence inductrice propre au mésenchyme associé. Ces modifications morphologiques de la bronche correspondent-elles à un changement du métabolisme cellulaire ?

Différenciation histochimique

Sigot (1963) a montré que la différenciation du gésier s’accompagne d’une accumulation de glycogène dans les cellules épithéliales. Dans l’épithélium bronchique par contre, cette substance n’existe pas normalement ou seulement à l’état de traces. Nous nous sommes demandée si le mésenchyme de gésier, qui influence la morphologie de la bronche en association hétérologue, modifie aussi son métabolisme en provoquant la synthèse de glycogène comme il le fait avec l’épithélium de proventricule.

Nous avons donc recherché le glycogène dans des associations cultivées ou greffées à l’aide de la réaction au P.A.S. Nous n’en avons jamais détecté. L’épithélium bronchique, placé sous l’influence du mésenchyme de gésier, n’acquiert pas la capacité de synthétiser du glycogène.

(b) Mésenchyme hépatique et foie jeune

Vingt-six bronches ont été associées à du mésenchyme hépatique et 28 à du foie jeune de 3,5 jours d’incubation. Dix-sept d’entre elles dans le premier cas et 25 dans le second cas ont évolué.

Dans les deux types d’associations in vitro, l’épithélium bronchique prolifère et forme soit des replis et villosités, soit des digitations (planche 2, fig. 10). Il se différencie et s’épaissit beaucoup. Lorsque la bronche est cultivée au contact du foie jeune, les cellules hépatiques s’associent très étroitement à la bronche et s’incorporent à elle : il est difficile d’apprécier la limite entre les tissus pulmonaires et hépatiques.

L’évolution des greffons, par contre, est moins bonne qu’i” vitro. Il est possible que se produisent in ovo certaines inhibitions qui n’existent pas en culture où les tissus sont soustraits aux influences du reste de l’organisme.

(c) Conclusions

En conclusion, les mésenchymes issus du tube digestif ou de son annexe hépatique stimulent le développement de la bronche mais en modifient l’organisation architecturale. L’influence du mésenchyme dans les conditions de culture que nous avons utilisées ne semble cependant pas atteindre le métabolisme profond de la cellule pulmonaire.

3. Mésenchymes issus d’organes quelconques éloignés du territoire pulmonaire

(a) Mésenchyme dermique

Au contact du derme, la bronche se ramifie et se différencie dans tous les cas (28) en culture. La morphogenèse est importante. La paroi épithéliale, très épaissie, forme des replis et des digitations nombreuses (planche 3, fig. 11). La bronche se cloisonne parfois en plusieurs compartiments, des travées recoupant complètement ou partiellement la lumière: il est possible que le derme, se développant dans un plan, perturbe la structure tubulaire de la bronche.

Dans 6 cas, nous avons séparé les deux ébauches par une membrane vitelline. Les 6 expiants ont évolué; 2 ont restés bien structurés, 4 se sont étalés partiellement. Dans tous les cas, l’épithélium s’est différencié; il a proliféré et formé des ramifications (planche 3, fig. 12). Le derme peut donc agir à distance sur l’épithélium bronchique.

(b) Mésenchyme métanéphrique

En présence du mésenchyme métanéphrique, en culture, l’épithélium bronchique prolifère et développe des digitations dans 17 cas sur 23. Il s’amincit assez nettement.

Dans 21 cas, nous avons interposé une membrane vitelline entre la bronche et la mésenchyme métanéphrique. Neuf bronches se sont étalées, 12 ont conservé leur structure. L’épithélium, d’aspect cubique ou palissadique, a proliféré et formé des replis ou, dans 6 cas, de petites digitations (planche 3, fig. 13).

Lorsque culture et greffe sont combinées (12 cas), la bronche suit une évolution un peu différente. Dans 7 cas, elle apparaît sous forme d’un tube simple constitué d’un épithélium cubique ou palissadique et pouvant rappeler d’assez loin un uretère. Le mésenchyme métanéphrique est lui-même induit par l’épithélium pulmonaire à former des îlots de tubules secréteurs et des glomérules dans 11 cas sur 12 (planche 3, fig. 14). Il se produit donc une induction réciproque des deux ébauches associées: la structure de la bronche se simplifie, l’épithélium s’amincit; la différenciation des tubules au contact de cet épithélium montre que le mésenchyme métanéphrique est déterminé et qu’il évolue selon sa nature propre.

(c) Mésenchyme mésonéphrique

Vingt-huit bronches ont été cultivées en association avec du mésonéphros de 3 à 5 jours; 6 bronches ont été greffées directement dans le territoire présomptif du mésenchyme mésonéphrique et laissées en place pendant 5 jours.

Dans tous les cas, le bourgeon pulmonaire se dilate en vésicule plus ou moins volumineuse, à paroi mince. L’épithélium est quelquefois cubique et le plus souvent aplasique et dédifférencié.

(d) Mésenchyme céphalique

Dans les 21 associations réalisées in vitro, la bronche s’est dédifférenciée et a régressé presque complètement ou a formé une vésicule à paroi mince (planche 4, fig. 15).

(e) Allantoïde

Quinze associations ont été cultivées et 8 bronches ont été greffées sur la membrane chorio-allantoïdienne. Ces deux séries ont donné les mêmes résultats. Le bourgeon pulmonaire est resté sain mais n’a pas évolué.

(f) Mésenchyme somitique

Le mésenchyme somitique, prélevé sur des embryons de 2,5 à 3 jours d’incubation, a été associé à la bronche dans 56 cas en culture. Nous n’avons observé aucune évolution. La bronche s’est vésiculisée.

(g) Conclusions

La bronche est capable de réagir à l’induction de quelques mésenchymes hétérologues ne provenant pas du tube digestif : elle évolue au contact du derme et du mésenchyme métanéphrique. Par contre, elle ne se développe pas en présence des mésenchymes mésonéphrique, céphalique, allantoïdien et somitique Ces différences d’évolution sont-elles dues à une inégalité dans le degré d’activité morphogène de ces mésenchymes ? ou à l’antagonisme de certains d’entre eux envers l’épithélium bronchique?

Le derme et le mésenchyme métanéphrique sont capables, comme le mésenchyme pulmonaire, d’induire la différenciation de la bronche à travers une membrane vitelline. Des substances actives, élaborées par ces mésenchymes, diffusent donc vers l’épithélium pour en déclencher la morphogenèse.

4. Mésenchyme issu d’une autre classe zoologique

Nous avons essayé d’obtenir la différenciation de la bronche de Poulet sous l’influence d’un mésenchyme xénoplastique, le mésenchyme homologue pulmonaire de Souris. Les expiants survivent parfois assez difficilement car les tissus de Souris tendent à se nécrosser rapidement.

Toutefois, la bronche de Poulet poursuit sa morphogenèse au sein du mésenchyme pulmonaire de Souris de 11 jours de gestation dans 11/17 cas en culture et 4/5 cas en greffe. L’observation macroscopique des cultures montre une évolution comparable à celle des réassociations des deux ébauches pulmonaires de Poulet. Une partie des cellules mésenchymateuses se condense en manchon autour de la bronche de Poulet. L’épithélium, de type pseudostratifié, prolifère et se ramifie. De nombreux bourgeons dont l’aspect est typiquement pulmonaire, se sont formés en particulier dans les greffons (planche 4, figs. 16, 17). Le mode de bourgeonnement est soit monopodique comme dans le poumon de Poulet, soit dichotomique comme dans le poumon de Souris. Ce type de morphogenèse intermédiaire a aussi été obtenu par Taderera (1967) dans les associations d’épithélium pulmonaire de Souris et de mésenchyme pulmonaire de Poulet.

Ces résultats indiquent que des constituants différents d’un même organe mais de classes differentes se reconnaissent et collaborent. Comme le suggère Wolff (1957), ‘aux homologies morphologiques doivent correspondre des homologies profondes de nature biochimique’.

C. Conclusions

1. L’ensemble de ces résultats, résumé dans le tableau 2, montre la spécificité du mésenchyme pulmonaire dans la différenciation caractéristique de l’épithélium bronchique. Cette spécificité existe malgré les différences de parenté zoologique entre les tissus puisque le mésenchyme pulmonaire de Souris est capable d’induire l’épithélium bronchique de Poulet à former des bourgeons typiquement pulmonaires.

Tableau 2.

Influence des mesenchymes hétérologues sur la morphogenèse de la bronche

Influence des mesenchymes hétérologues sur la morphogenèse de la bronche
Influence des mesenchymes hétérologues sur la morphogenèse de la bronche

2. Les associations entre bronche et divers mésenchymes hétérologues montrent aussi que des interactions sont possibles dans un système épithéliomésenchymateux inhabituel.

(a) Grâce à la stimulation de l’épithélium bronchique, les mésenchymes se différencient en structures caractéristiques et évoluent selon leur destinée normale: ils sont déjà déterminés au moment de l’explantation.

(b) La bronche peut se développer au contact de certains mésenchymes hétérologues (mésenchymes provenant du tube digestif, de la peau et du métanéphros) mais ceux-ci modifient son organisation architecturale: l’épithélium bronchique n’est pas déterminé.

L’influence des mésenchymes hétérologues sur la bronche peut s’exercer:

— par leur texture: en ce qui concerne les mésenchymes digestifs très denses, la différenciation des couches musculaires peut gêner la ramification de la bronche qui fait alors des replis ou des villosités;

— par l’intermédiaire d’une substance morphogène diffusible: nous avons vu que les mésenchymes dermique et métanéphrique agissent à distance. Il est probable que ceci est vrai pour d’autres mésenchymes.

— Il faut peut-être ajouter un certain effet trophique qui peut se produire entre deux tissus étrangers anormalement en contact.

(c) Cependant si de tels mésenchymes peuvent dévier la bronche de sa destinée morphologique normale, il ne semble pas que le métabolisme de l’épithélium bronchique soit modifié: n’ayant pas normalement la capacité de synthétiser du glycogène, cet épithélium ne l’acquiert pas au contact du mésenchyme de gésier. Il est intéressant de remarquer que l’endoderme hépatique (Le Douarîn, 1967) perd cette capacité au contact d’un mésenchyme hétérologue mais la retrouve si on réassocie cet endoderme avec son propre mésenchyme.

3. En conclusion, l’organogenèse pulmonaire s’effectue grâce à des interactions entre l’épithélium et le mésenchyme. Ce dernier élabore une substance morphogène qui diffuse vers l’épithélium pour en déclencher la différenciation. L’activité inductrice du mésenchyme sur l’épithélium bronchique est spécifique. La bronche peut néanmoins évoluer au sein de certains mésenchymes hétérologues mais ces derniers modifient sa morphologie.

Ceci nous amène à nous interroger sur la nature de la substance morphogène synthétisée par le mésenchyme. Nous pouvons nous demander s’il existe un ou plusieurs facteurs. Dans ce cas, peut-on distinguer un facteur de croissance générale propre à tous les tissus et un facteur spécifique responsable de la différenciation pulmonaire, limitant ou orientant l’action du premier facteur ? Les résultats que nous avons obtenus jusqu’ici ne nous permettent pas encore de répondre à ces questions.

  1. Nous avons étudié la nature et la spécificité des interactions épithéliomésenchymales au cours de l’organogenèse du poumon chez l’embryon de Poulet. Nous avons suivi l’évolution des bronches à partir du moment où elles commencent à se ramifier (114 à 120 h d’incubation). La plupart des expériences ont été faites en culture in vitro selon la méthode mise au point par Wolff & Haffen.

  2. L’interposition de membranes filtrantes entre les deux constituants pulmonaires a permis de déterminer la nature des interactions s’effectuant entre ces deux tissus. Les interactions peuvent s’exercer à distance par l’intermédiaire d’une substance inductrice élaborée par le mésenchyme. Cette substance est capable de diffuser à travers la membrane vitelline. Elle est arrêtée par la cellophane. Elle n’a que peu d’influence à travers une membrane Millipore. Elle est active à faible distance (inférieure à 25 μ).

  3. Des associations entre bronche et divers mésenchymes hétérologues montrent que certains d’entre eux (mésenchymes mésonéphrique, céphalique, allan-toïdien et somitique) ne sont pas favorables à la morphogenèse de la bronche. D’autres mésenchymes hétérologues, au contraire, permettent son évolution; les uns ont la même parenté embryologique que le mésenchyme pulmonaire (ils proviennent du tube digestif); d’autres sont très différents (c’est le cas du derme et du mésenchyme métanéphrique); enfin, un mésenchyme xénoplastique, le mésenchyme pulmonaire de Souris, est tout à fait favorable. Ces mésenchymes hétérologues favorables modifient l’organisation architecturale de la bronche. Seul, le mésenchyme pulmonaire induit spécifiquement la différenciation caractéristique de la bronche. Le mésenchyme pulmonaire de Souris est, lui aussi, capable d’induire l’épithélium bronchique de Poulet à former des bourgeons typiquement pulmonaires.

An experimental study of the organogenesis of the lung: the nature and specificity of the epithelio-mesenchymatous interactions

  1. The nature and specificity of epithelio-mesenchymal interactions have been studied during chick lung organogenesis. The evolution of bronchi has been observed from the moment when they begin to branch out (after 114-120 h of incubation). Most of the experiments have been made in culture using Wolff & Haffen’s method.

  2. Filter membranes laid between the epithelium and mesenchyme of the lung allowed the determination of the nature of interactions which take place between these two tissues. The interactions can occur at a distance, through an inductive substance elaborated by the mesenchyme. This substance is able to diffuse across the vitelline membrane of a hen’s egg. It is stopped by a cellophane filter. It has only slight influence across a Millipore filter. It is active at distances of less than 25 μ.

  3. Associations between bronchus and various heterologous mesenchymes show that some of them (mesonephric, cephalic, allantoic and somitic mesenchymes) are unfavourable to bronchial morphogenesis. Others, on the contrary. allow its evolution: among these, some have the same embryologic origin as the lung mesenchyme (they come from the digestive tract); others are very different (like dermic and metanephric ones) ; finally, a xenoplastic mesenchyme, the mouse lung one, is quite favourable. These favourable heterologous mesenchymes influence the bronchial architectural organization. Only lung mesenchyme specifically induces the characteristic differentiation of the bronchus. The mouse pulmonary mesenchyme is also able to induce the chick lung epithelium to develop typically pulmonary buds.

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PLANCHE 1

L’échelle des figures représente une valeur de 100 μ.: e. épithélium bronchique; f.m., filtre Millipore; mésenchyme pulmonaire; m.v” membrane vitelline.

Fig. 2, 3. Interposition d’une membrane vitelline entre l’épithélium et le mésenchyme pulmonaires. Aspect histologique après 5 jours de culture.

Fig. 2. L’épithélium bronchique s’est différencié, surtout du côté du mésenchyme, et a proliféré en formant des replis.

Fig. 3. La structure tubulaire de la bronche n’est plus reconnaissable. Mais l’épithélium s’est différencié et a formé de nombreux replis.

Fig. 4, 5. Interposition d’une membrane Millipore entre l’épithélium et le mésenchyme pulmonaires. Aspect histologique après 5 jours de culture.

Fig. 4. Filtre Millipore de type PH (épaisseur de 150μ, diamètre des pores de 0,3 μ). La bronche s’est étalée sur le filtre et n’a pas fait de morphogenèse.

Fig. 5. Filtre Millipore de type TH (épaisseur de 25 μ, diamètre des pores de 0,45 μ). Même évolution.

PLANCHE 1

L’échelle des figures représente une valeur de 100 μ.: e. épithélium bronchique; f.m., filtre Millipore; mésenchyme pulmonaire; m.v” membrane vitelline.

Fig. 2, 3. Interposition d’une membrane vitelline entre l’épithélium et le mésenchyme pulmonaires. Aspect histologique après 5 jours de culture.

Fig. 2. L’épithélium bronchique s’est différencié, surtout du côté du mésenchyme, et a proliféré en formant des replis.

Fig. 3. La structure tubulaire de la bronche n’est plus reconnaissable. Mais l’épithélium s’est différencié et a formé de nombreux replis.

Fig. 4, 5. Interposition d’une membrane Millipore entre l’épithélium et le mésenchyme pulmonaires. Aspect histologique après 5 jours de culture.

Fig. 4. Filtre Millipore de type PH (épaisseur de 150μ, diamètre des pores de 0,3 μ). La bronche s’est étalée sur le filtre et n’a pas fait de morphogenèse.

Fig. 5. Filtre Millipore de type TH (épaisseur de 25 μ, diamètre des pores de 0,45 μ). Même évolution.

PLANCHE 2

b. I, bronche primaire; b. Il, bronche secondaire; c.h., cellules hépatiques; e., épithélium bronchique; m., mésenchyme pulmonaire; m.i., mésenchyme intestinal; m.pr., mésenchyme de pro ventricule; pb., parabronche.

Fig. 7. Bronche associée à du mésenchyme pulmonaire. Aspect histologique après 18 h de culture et 6 jours de greffe. Morphogenèse importante.

Fig. 8. Bronche associée à du mésenchyme intestinal. Aspect histologique après 18 h de culture et 6 jours de greffe. Le greffon a un aspect intestinal.

Fig. 9. Bronche associée à du mésenchyme de proventricule. Aspect histologique après 18 h de culture et 6 jours de greffe. La bronche est pluristratifiée; elle est enveloppée par les couches musculaires qui se sont différenciées dans le mésenchyme de proventricule.

Fig. 10. Bronche associée à du foie jeune. Aspect histologique après 5 jours de culture. La bronche dessine des villosités à la manière d’une muqueuse intestinale.

PLANCHE 2

b. I, bronche primaire; b. Il, bronche secondaire; c.h., cellules hépatiques; e., épithélium bronchique; m., mésenchyme pulmonaire; m.i., mésenchyme intestinal; m.pr., mésenchyme de pro ventricule; pb., parabronche.

Fig. 7. Bronche associée à du mésenchyme pulmonaire. Aspect histologique après 18 h de culture et 6 jours de greffe. Morphogenèse importante.

Fig. 8. Bronche associée à du mésenchyme intestinal. Aspect histologique après 18 h de culture et 6 jours de greffe. Le greffon a un aspect intestinal.

Fig. 9. Bronche associée à du mésenchyme de proventricule. Aspect histologique après 18 h de culture et 6 jours de greffe. La bronche est pluristratifiée; elle est enveloppée par les couches musculaires qui se sont différenciées dans le mésenchyme de proventricule.

Fig. 10. Bronche associée à du foie jeune. Aspect histologique après 5 jours de culture. La bronche dessine des villosités à la manière d’une muqueuse intestinale.

PLANCHE 3

d” derme; e., épithélium bronchique; g., glomérule; m.c., marques de charbon; m.m., mésenchyme métanéphrique; m.v., membrane vitelline; t.s., tubules secréteurs.

Fig. 11. Bronche associée à du derme. Aspect histologique après 5 jours de culture. Différenciation et ramification de l’épithélium bronchique.

Fig. 12. Bronche associée à du derme mais avec une membrane vitelline interposée entre les deux tissus. Aspect histologique après 5 jours de culture. Le derme agit à distance sur l’épithélium bronchique qui s’est différencié et ramifié.

Fig. 13. Bronche associée à du mésenchyme métanéphrique. Membrane vitelline interposée entre les deux tissus : le mésenchyme métanéphrique agit à distance sur l’épithélium bronchique qui s’est différencié et a proliféré.

Fig. 14. Bronche associée à du mésenchyme métanéphrique. Aspect histologique après 18 h de culture et 5 jours de greffe. La bronche forme un tube simple bordé d’un épithélium palissadique ou pseudostratifié. Noter la différenciation de tubules secréteurs et de glomérules dans le mésenchyme métanéphrique.

PLANCHE 3

d” derme; e., épithélium bronchique; g., glomérule; m.c., marques de charbon; m.m., mésenchyme métanéphrique; m.v., membrane vitelline; t.s., tubules secréteurs.

Fig. 11. Bronche associée à du derme. Aspect histologique après 5 jours de culture. Différenciation et ramification de l’épithélium bronchique.

Fig. 12. Bronche associée à du derme mais avec une membrane vitelline interposée entre les deux tissus. Aspect histologique après 5 jours de culture. Le derme agit à distance sur l’épithélium bronchique qui s’est différencié et ramifié.

Fig. 13. Bronche associée à du mésenchyme métanéphrique. Membrane vitelline interposée entre les deux tissus : le mésenchyme métanéphrique agit à distance sur l’épithélium bronchique qui s’est différencié et a proliféré.

Fig. 14. Bronche associée à du mésenchyme métanéphrique. Aspect histologique après 18 h de culture et 5 jours de greffe. La bronche forme un tube simple bordé d’un épithélium palissadique ou pseudostratifié. Noter la différenciation de tubules secréteurs et de glomérules dans le mésenchyme métanéphrique.

PLANCHE 4

e., épithélium bronchique; m,c., mésenchyme céphalique; m.p., mésenchyme pulmonaire de souris; m.v., membrane vitelline.

Fig. 15. Bronche associée à du mésenchyme céphalique. Aspect histologique après 5 jours de culture. Ballonnement de la bronche.

Fig. 16, 17. Bronche associée à du mésenchyme pulmonaire de souris.

Fig. 16. Aspect histologique après 18 h de culture et 5 jours de greffe. L’épithélium bronchique de poulet est pluristratifié. Il a formé de nombreux bourgeons.

Fig. 17. Aspect histologique après 18 h de culture et 5 jours de greffe. Détail montrant, vers la droite, des bourgeons dichotomiques et, vers la gauche, un bourgeon monopodique. Les bourgeons ont un aspect typiquement pulmonaire.

PLANCHE 4

e., épithélium bronchique; m,c., mésenchyme céphalique; m.p., mésenchyme pulmonaire de souris; m.v., membrane vitelline.

Fig. 15. Bronche associée à du mésenchyme céphalique. Aspect histologique après 5 jours de culture. Ballonnement de la bronche.

Fig. 16, 17. Bronche associée à du mésenchyme pulmonaire de souris.

Fig. 16. Aspect histologique après 18 h de culture et 5 jours de greffe. L’épithélium bronchique de poulet est pluristratifié. Il a formé de nombreux bourgeons.

Fig. 17. Aspect histologique après 18 h de culture et 5 jours de greffe. Détail montrant, vers la droite, des bourgeons dichotomiques et, vers la gauche, un bourgeon monopodique. Les bourgeons ont un aspect typiquement pulmonaire.