ABSTRACT
An estimate of content and localization of lithium within lithium-treated amphibian embryos has been made by means of autoradiography after neutron irradiation.
An accumulation of lithium in the dorsal part of the embryo and a concentration associated with the pigment granules was observed.
Nous tenons à remercier le Centre de Physique nucléaire de Bruxelles et en particulier M. le Dr Picciotto pour l’aide et les conseils qu’il nous a prodigués à l’occasion de ce travail. Notre gratitude va également au Service de la Pile de Châtillon et à Mme H. Faraggi grâce à qui les irradiations ont pu être effectuées.
INTRODUCTION
Il Y A tout lieu d’espérer qu’une meilleure compréhension des curieux effets que le lithium exerce sur la morphogénèse rendrait de grands services pour l’étude de la détermination et de la différenciation embryonnaires.
Jusqu’à présent, cependant, le mode d’action de cét ion nous a échappé, en partie parce qu’il n’existe pas de méthode chimique assez sensible pour doser cet élément au point de permettre de déterminer sa localisation intracellulaire.
Il nous a semblé intéressant d’appliquer une nouvelle technique d’analyse autoradiographique du lithium par irradiation neutronique (Picciotto & Van Styvendael, 1951) et de l’adapter à cet important problème d’embryologie.
Nous avons donc tenté de suivre la distribution de l’élément toxique dans des coupes d’embryons lithinés de Batraciens à divers stades de leur développement.
La méthode autoradiographique nous ayant permis d’évaluer la concentration en lithium des embryons, nous avons cherché à contrôler ces données par des dosages de la teneur en lithium: la spectrographic d’émission nous a permis d’atteindre ce but, tant dans les embryons entiers que dans les fragments d’embryons et les fractions d’homogénats isolées par centrifugation différentielle.
PARTIE EXPÉRIMENTALE
(a) Principe de la méthode
En soumettant à un flux de neutrons thermiques d’intensité convenable des coupes d’embryons lithinés, recouvertes d’émulsion photographique ‘Pour recherches nucléaires’, les atomes de lithium, en se désintégrant, émettent deux particules (a et triton) dont les trajectoires impressionnent l’émulsion sensible.
Le lithium comporte deux isotopes: 6Li, 7-39 pour cent; et 7Li, 92-61 pour cent.
La pile atomique permet d’obtenir des flux de neutrons thermiques importants, ce qui est essentiel dans le cas de tels dosages, à l’exclusion des neutrons rapides qui donnent lieu à des protons de recul.
La technique photographique utilisée comme moyen de détection (Powell, Occhialini, Livesey, & Chilton, 1946) est basée sur l’observation des trajectoires individuelles et non sur celle du noircissement global, comme dans les méthodes autoradiographiques classiques. Le passage d’une particule ionisante à travers une émulsion sensible impressionne les grains d’halogénure d’argent traversés par la particule.
Les émulsions photographiques ‘Pour recherches nucléaires’ sont caractérisées par une concentration très élevée en AgBr et une dimension de grains de quelques dixièmes de microns. Il existe plusieurs types d’émulsion de sensibilités différentes. En développant l’image latente formée on peut révéler la trajectoire de la particule.
L’aspect d’une trajectoire est fonction de l’ionisation produite par la particule de son énergie et de la méthode de développement photographique utilisée.
Les conditions d’irradiation et de développement des émulsions nucléaires exposées à des flux intenses de neutrons ont été discutées par Faraggi, Bonnet, & Cohen (1952). La dose maxima de neutrons tolérable par la plaque est limitée par le noircissement dû aux rayons y et /3.
De plus, des trajectoires parasites sont dues à la présence d’éléments pouvant prêter à des confusions. La réaction (n, p) de l’azote donne lieu à des protons, dont la trajectoire a une longueur de 6p. Le choc des neutrons rapides sur l’hydrogène de la préparation et de la gélatine produit des protons de recul qui ne sont discernables des tritons du Li+ que si leur trajectoire excède 36u.
Les traces des protons de recul inférieures à 36/x, et celles qui sont dues à la contamination de la préparation en lithium constituent le back-ground qu’il faut évidemment soustraire du nombre total de traces observées.
(b) Application de la méthode aux œufs d’Amphibiens
Des œufs indivis et des blastulas, préalablement dégangués, ont séjourné pendant 3 heures dans une solution de LiCl, à la concentration de 1 pour cent, dans le cas des Axolotls, de 0 66 pour cent dans celui des Pleurodèles. Après lavage à l’eau courante, les embryons ont été fixés par congélation sous vide (freeze-drying), selon Gersh (1938). L’emploi d’un fixateur chimique qui eût, presqu’à coup sûr, déplacé l’ion Li+, très mobile, a été ainsi évité.
Les embryons, après la fixation par congélation brusque dans de l’isopentane à la température de l’air liquide, ont été déshydratés pendant 48 heures à - 40° C., sous un vide poussé.
L’inclusion à la paraffine a été également effectuée sous vide.
Des coupes de 10μ ont été déposées sur une lame porte-objet traitée au préalable par une solution de gélatine à l’alun, afin d’améliorer l’adhérence de l’émulsion photographique; l’albumine, dans ce cas, n’est pas nécessaire. Les coupes ont ensuite été étalées dans une goutte d’alcool pour éviter l’éventuelle diffusion du Li+ dans l’eau.
Les lames ont été alors séchées à la température ordinaire; les coupes déparaffinées dans le xylol (déshydraté par CaCl2) ont été ensuite recouvertes de l’émulsion sensible (G5 Ilford).
Cette émulsion a été fondue au bain-marie à la température de 48° et une goutte d’environ 01 c.c. a été déposée à l’endroit de la préparation, de manière à obtenir une épaisseur de 50 à 100μ d’émulsion sèche.
Les lames ont alors été séchées à nouveau pendant 24 heures dans un courant d’air tiède; toutes ces manipulations s’effectuaient, bien entendu, en chambre noire, à la lumière rouge.
Les préparations pouvaient, dès lors, être exposées au flux de neutrons. Diverses séries de coupes ont été soumises à un bombardement de 109, 1010, et 1011 neutrons/cm.2, à la pile de Châtillon. Le flux limite, pour ces émulsions, semble être de 1010/cm.2 L’usage des émulsions du type Ilford E 1 que nous ne possédions pas à ce moment aurait permis un flux de 1011 neutrons /cm.2 (Faraggi et al., 1952).
Une seconde méthode a consisté à appliquer, contre la préparation biologique, une plaque sensible (Emulsion C 2) et à exposer le tout aux neutrons. Cette technique implique toutefois un repérage qui peut introduire certaines causes d’erreurs.
L’observation simultanée de la préparation et de l’émulsion, qui est rendue possible par la méthode de l’émulsion coulée, s’est montrée à la fois moins fastidieuse et plus précise. Elle offre, également, l’avantage de permettre une localisation immédiate.
Les plaques photographiques et les émulsions coulées ont ensuite été développées par la méthode d’Occhialini-Dilworth (Dilworth et al., 1950) où l’imprégnation de l’émulsion par le révélateur se fait à 4° pendant 45 minutes. L’action révélatrice étant inhibée à cette température, la révélation sera homogène quand le développement aura lieu, hors du bain, à 22° pendant 45 minutes.
Le développement photographique a tout avantage à être effectué le plus vite possible après l’exposition à la pile, certains éléments activés émettant des traces parasites qui peuvent brouiller l’observation.
Le révélateur utilisé fut le suivant:
Après un bain d’arrêt, les préparations sont fixées dans une solution concentrée d’hyposulfite.
La fixation est terminée après 5 heures environ et les plaques sont alors lavées par élimination progressive du fixateur à l’eau courante.
Ce séchage final doit être lent, pour éviter les déformations de la gélatine (Planche, fig. A et B).
(c) Résultats des expériences
Cinq séries d’expériences ont porté sur des œufs non segmentés et des blastulas de Pleurodèles et d’Axolotl, ainsi que sur des œufs indivis de Pleurodèles qui avaient été centrifugés dans une solution isotonique de saccharose.
Chaque expérience comportait des lots d’embryons lithinés et d’embryons témoins: ces derniers, à part le traitement au lithium, étaient soumis à toutes les manipulations qui viennent d’être décrites.
L’observation microscopique des coupes a permis de représenter l’origine des traces sur un graphique, selon les coordonnées du chariot de la platine microscopique (figs. 1,2, et 3, dans le texte).
Répartition du lithihum dans une coupe de Pleurodèle. 2.1010 neutrons/cm.2 L’embryon est divisé en deux parties égales, la moitié dorsale étant limitée par un trait gras.
Répartition du lithium dans une coupe d’œuf indivis de Pleuro-dèle, centrifugé. 1010 neutrons/cm.2 Deux traits limitent la région correspondante aux mitochondries et aux grains de pigment où la concentration en lithium est plus élevée.
Répartition du lithium dans une coupe de blastula avancée d’Axolotl. 2.1010 neutrons/cm.2 L’embryon est divisé en deux parties égales, la moitié dorsale étant limitée par un trait gras.
Il ressort des observations autoradiographiques que, dans l’œuf indivis, tant chez le Pleurodèle que chez l’Axolotl la distribution du Li+ dans les embryons traités est homogène.
Dans les coupes-témoins, la concentration en Li+ est sensiblement du même ordre de grandeur que celle du back-ground, qui était d’ailleurs relativement élevé: le verre et la gélatine sont toujours légèrement contaminés par du lithium, comme l’a d’ailleurs confirmé l’analyse spectrographique de leurs cendres.
Dans les blastulas des deux espèces un rapport de 19 a été observé entre les moitiés dorsales et ventrales. Sur les 1,500 traces dénombrées dans les 10 coupes observées, 940 sont attribuables à l’ensemble des moitiés dorsales, 540 à l’ensemble des moitiés ventrales de l’embryon. Ces valeurs, et les erreurs probables sont consignées dans le tableau 1.
Les différences accusées par ces valeurs sont nettement supérieures aux fluctuations statistiques: il y a donc une accumulation du lithium dans la région dorsale à la fin de la segmentation.
Dans les coupes d’œufs centrifugés, une concentration accrue du lithium se manifeste, dans 75 pour cent des cas étudiés, au niveau de la zone correspondant aux grains de pigment et aux mitochondries.
Enfin, nous avons tenté d’estimer la concentration en Li+ dans les embryons lithinés. Pour donner à cette mesure une valeur absolue il faudrait connaître avec exactitude le nombre de neutrons et le parcours du lithium dans l’échantillon.
Nous avons trouvé, dans les embryons intoxiqués, une concentration de 6.10_4 gr. de Li/gr. de poids sec, soit 0 06 pour cent.
(d) Dosage du lithium par spectrographie d’émission
Afin de vérifier ces résultats, nous avons effectué un contrôle par la spectrographie d’émission, méthode d’analyse également très sensible.
L’analyse a été effectuée avec des microélectrodes de graphite, forées d’un trou pour y déposer l’échantillon. Chaque échantillon déposé a été pesé à la microbalance afin d’obtenir des résultats quantitatifs.
La ligne 6707 Â a été utilisée pour les mesures quantitatives. La fente était de 35/x, le courant de 6 ampères et le temps de 30 secondes. Les plaques Gevaert, G Scientia 58 A 64, micrograin panchro ont été développées pendant 5 minutes dans du révélateur DK 50, puis fixées au fixateur F 54 a.
Nous avons procédé à deux types d’expériences: tout d’abord des dosages du Li ont été effectués dans des embryons entiers et dans des moitiés dorsales et ventrales d’embryons lithinés ou non; ensuite, nous avons suivi la teneur en lithium des diverses fractions d’homogénats d’embryons, isolées par centrifugation différentielle.
Lors des premières expériences, nous avons déposé chaque embryon sur un verre de montre en pyrex, absorbé l’excès de milieu au papier filtre, séché rapidement à la flamme et coupé l’embryon en deux, sous la loupe, au moyen d’une anse en platine.
Le tableau 2 donne les valeurs absolues en γ de lithium correspondant aux différents échantillons.
Concentration du lithium déterminée par spectrographic d’émission dans des embryons d’Amphibiens lithinés

Des mesures de la teneur en lithium des solutions utilisées pour la culture (Holtfreter) et pour le traitement des embryons (LiCl 0 · 66 pour cent dans l’eau de ville) ont été faites, en outre, sur des gouttes de 25 mm3, prélevées à la micropipette.
Les mesures spectrographiques ont été effectuées par le Docteur D. Shugar, à qui va notre gratitude.
Enfin, dans un but d’étalonnage, nous avons injecté dans des œufs témoins, une quantité connue de lithium (0 05y). Ces injections ont été effectuées au moyen du micromanipulateur de de Fonbrune, par Melle S. Gothié, que nous remercions vivement. Le tableau 2 donne les résultats de ces essais.
Alors que les observations faites par l’autoradiographie avaient fourni des valeurs qui étaient dans le rapport de 1·9 pour les moitiés dorsales et ventrales de la blastula, les mesures spectrographiques, on le voit, ont montré des différences plus accusées encore (rapport de 2· 5 entre les deux types de fragments). Cette divergence apparente peut tenir à la densité élevée du vitellus; nous avons en effet tenu compte, non des volumes, mais des poids secs des moitiés d’embryons, lors des mesures spectrographiques.
Lors de la deuxième série d’expériences, nous avons utilisé la technique de fractionnement décrite par Recknagel (1950), où l’homogénéisation des embryons de Batraciens s’effectue dans un tampon au phosphate 0·05 M à pH 7·4.
Pour éviter les échanges possibles entre le Li+ et le K+ de la solution tampon, nous avons remplacé, par la suite, le milieu au phosphate par une solution de saccharose isotonique (0 25 M) dans de l’eau bidistillée. Une solution hypertonique (0-88 M), qui avait été utilisée lors d’un premier essai, ne s’élimine pas complètement lors de la dessiccation des culots de centrifugation et ne convient donc pas.
Ces expériences ont porté sur des lots comportant un nombre égal d’œufs lithinés et d’œufs témoins (Pleurodèles 90,125,150,150).
Les constituants suivants ont été isolés:
le vitellus, qui se sédimente à 50 g., après 15 minutes;
les granules de pigment mélanique sédimentés à 2,000 g. après 10 minutes;
les mitochondries qui se déposent à 2,000 g. après 40 minutes.
Nous avons tenté ensuite d’isoler la fraction des microsomes en centrifugeant le surnageant, pendant 35 minutes, à 33,500 t/minutes à l’ultracentrifugeuse Spinco: mais le culot ainsi obtenu a été tellement minime qu’il n’a pas été possible de l’analyser.
le surnageant de l’ultracentrifugation, qui comprend un peu de lipides, a été évaporé.
On trouvera, dans le tableau 3, les résultats de ces dosages.
Concentration du lithium des fractions d’homogénats d’embryons lithinés et non, isolées par centrifugation différentielle. T = Témoins; Li = Lithinés

En analysant ces résultats, on observe que les concentrations les plus élevées en Li+ correspondent au surnageant et à la fraction granulaire pigmentée.
Il paraît évident que le Li+, labile, risque de diffuser dans le milieu d’homo-généinisation: sa présence dans le surnageant n’est donc nullement surprenante.
La teneur élevée du vitellus en lithium dans les expériences II et III peut s’expliquer par la difficulté d’obtenir une sédimentation très nette lorsque la centrifugation se fait dans le saccharose: cette fraction vitelline risque donc d’être contaminée par une petite proportion de granules pigmentaires qui se déposent déjà à faible vitesse.
La concentration élevée du lithium dans les granules de pigment, que montrent ces expériences, concorde bien avec les observations faites plus haut par autoradiographie: on a vu que le lithium s’accumule dans l’anneau pigmentaire des œufs entiers centrifugés.
(e) Distribution du lithium pendant l’oogénèse
Enfin, nous avons tenté une expérience ‘in vivo’ sur une grenouille en période d’oogénèse active: une injection de 2 c.c. de Ringer pour Batraciens, contenant 30y de Li, a été faite à 3 reprises, à 24 heures d’intervalle, dans la cavité péritonéale d’une Rana fusca femelle.
Les fragments de l’ovaire de l’animal lithiné et d’une grenouille témoin ont été fixés par Freezing-Drying; ils ont ensuite été traités comme dans les expériences précédentes d’autoradiographie.
Dans 28 coupes d’oocytes observées, on a obtenu une moyenne de 10 traces par oocyte, réparties également dans la vésicule germinative et dans le cytoplasme (fig. 4 dans le texte).
Répartition du lithium dans une coupe d’ovaire de Rana fusca injectée de Li+. 1010 neutrons/cm.2
La concentration, calculée par la formule de la section efficace, est de 5. 10−4 gr. / gramme de poids sec.
Dans ce cas, encore, le contrôle spectrographique s’est montré pleinement satisfaisant; il a indiqué une teneur en Li+ du même ordre de grandeur que celle que l’on trouve dans les œufs en voie de développement.
Les oocytes-témoins ne contiennent, par contre, qu’une quantité négligeable de l’élément.
Il semble donc qu’à ce stade la perméabilité de la membrane oocytaire soit telle que le Li+ puisse pénétrer et, éventuellement, se concentrer dans l’ovaire.
DISCUSSION
De nombreuses hypothèses ont été émises en ce qui concerne le lieu et le mode d’action du lithium, tant chez les Échinodermes que chez les Batraciens; on a supposé, notamment, qu’il pourrait s’agir d’une rupture de l’équilibre entre les diverses fractions de particules (Gustafson, 1952), d’une atteinte du métabolisme glucidique et phosphoré (Lindahl & Kiessling, 1951), d’une action sur l’état physique de certaines protéines ovulaires (Ranzi, 1951), ou d’une lésion du noyau cellulaire: en ce qui concerne cette dernière hypothèse, on ne peut oublier que le noyau intervient indirectement dans le développement des particules cytoplasmiques (Brachet, 1952). Nous savons aussi, par les travaux de Raven et de son école (1952), que les noyaux des œufs de limnée traités par le lithium présentent des anomalies cytologiques.
Dans ces conditions, il n’est pas étonnant que nous ayons observé une accumulation du lithium dans la région de l’embryon où, simultanément, les populations de granules cytoplasmiques sont les plus denses, les noyaux les plus nombreux, le métabolisme le plus actif et la morphogénèse la plus intense. Dans le cas des Batraciens, c’est la région dorsale de l’embryon qui est, en outre, la plus pigmentée. Hall (1942) avait remarqué déjà, en opérant sur des explantats, que l’ectoderme lithiné peut dans certains cas se développer de façon normale, alors que l’organisateur lithiné ne le fait jamais. Hall en a conclu que le Li+ agirait surtout sur l’organisateur.
Pour en revenir à nos propres observations, nous n’avons malheureusement pas pu préciser si l’accumulation du lithium se produit dans les noyaux ou si elle est strictement cytoplasmique. Dans le cytoplasme, en tous cas, les dosages ont démontré une localisation préférentielle dans les granules mélaniques.
Le rôle physiologique des granules de pigment n’est pas encore suffisamment connu pour qu’on puisse déterminer la nature du système enzymatique qui serait inhibé par le lithium à leur niveau. La seule tentative qui ait été faite dans ce sens a été celle de Recknagel (1950): il a observé que les grains de pigment contiennent une certaine proportion, d’ailleurs inférieure à celle qu’on trouve dans les mitochondries, de cytochrome-oxydase; mais on sait que cet enzyme n’est précisément pas touché par le lithium (Lallier, 1953). On ne peut donc encore émettre aucune hypothèse valable sur la signification que pourrait avoir l’accumulation du lithium dans les grains de pigment, tant en ce qui concerne la morphogénèse que la biochimie du développement.
RÉSUMÉ
Un essai de dosage et de localisation du lithium dans les embryons de Batraciens lithinés a été entrepris au moyen de l’autoradiographie par irradiation neutronique.
Une accumulation de lithium dans la partie dorsale de l’embryon et une concentration de ce toxique au niveau des granules de pigment ont été observées.
TRAVAUX CITÉS
EXPLICATION DE LA PLANCHE
FIG. A. Traces d’a et de tritons issues d’une coupe de blastula d’Axolotl lithinée.
FIG. B. Trajectoire d’a et de triton (36M) dans l’émulsion photographique.