The analysis of neural induction by means of organizers tagged by glycine and orotic acid has demonstrated the migration of radioactive substances during neuralization.

The incorporation of these precursors, both as regards proteins and nucleic acids, is greatest in regions undergoing active morphogenesis. It seems to be particularly intense in the nuclei.

Des expériences de Brachet (1949) ont montré, de manière indirecte, que l’induction neurale semble s’accompagner d’une migration de granules colorables vitalement au rouge neutre; ils passeraient du chordoblaste dans le neuroblaste et leur migration serait arrêtée par l’interposition d’une lamelle de cellophane.

Il nous a paru intéressant de reprendre ces expériences, en utilisant la méthode autoradiographique pour la mise en évidence d’une éventuelle diffusion des macromolécules marquées, de l’organisateur vers l’ectoderme; cette technique a le gros avantage de donner des renseignements sur les constituants naturels de l’embryon; ils ne peuvent être fournis lorsqu’on utilise des colorants vitaux nécessairement toxiques.

Nous avons employé la technique des émulsions nucléaires parce qu’elle permet une localisation précise et une estimation quantitative de l’isotope, tant dans le greffon que dans l’hôte.

En marquant par la glycine-l-14C et par l’acide orotique-2-14C des organisateurs de Batraciens, nous avons essayé de suivre le sort des protéines et des acides nucléiques de l’implantat: ces substances sont, en effet, des précurseurs des protéines et des acides nucléiques.

Nous avons essayé de voir si, sous cette forme complexe, la radioactivité décelée au niveau du greffon se retrouve dans les autres territoires de l’embryon et si elle s’y distribue suivant des modalités précises.

Les expériences ont donc eu pour but de suivre, pour la première fois, le sort d’un organisateur marqué, non par un colorant, mais par un constituant normal des cellules.

(a) Essais préliminaires et description de la méthode

Une expérience préliminaire a eu pour objet de suivre l’incorporation de la glycine-l-14C dans des embryons de Batraciens aux différents stades de leur développement. Nos observations ont porté sur deux espèces différentes: Rana fusca et le Pleurodèle (Pleurodeles watlii) aux stades suivants: oeufs indivis, blastulas, gastrulas et neurulas (stades 1,8,11, et 16 de Shumway).

Les embryons dégangués dans du Holtfreter stérile ont séjourné, pendant 3 heures, dans un milieu radioactif constitué de 5 c.c. de Holtfreter normal, stérile, additionné de glycocolle-l-14C à la concentration de 0 5 μM./c.c. (d’une activité de 450,000 c./minute/c.c.).

Un lavage dans du Holtfreter stérile contenant du glycocolle non marqué a été suivi de 2 lavages soigneux dans du Holtfreter pur.

Les embryons ont alors été fixés pendant 1 heure dans un mélange d’alcool et d’acide acétique (3:1), puis lavés à l’alcool à 70°, enrobés à la paraffine et coupés à 10/x sur des lames gélatinées.

Les coupes ont été recouvertes d’émulsion photographique suivant la technique décrite en détails dans un autre travail (Ficq, 1954). Après 5 jours d’exposition, les préparations ont été développées, fixées, lavées, et séchées.

L’examen microscopique a montré que la pénétration du glycocolle s’effectue mal dans les embryons entiers, ce qui confirme les observations que Friedberg & Eakin (1949), ainsi que Brachet & Brygier (1953) ont faites par d’autres méthodes; en conséquence, les expériences ultérieures ont été exécutées sur des fragments d’embryons où une incorporation appréciable peut être obtenue.

A la suite de ces essais préliminaires, nous avons traité des organisateurs isolés de Pleurodèles par la solution radioactive; après des lavages répétés, les fragments ont été implantés dans le blastocèle de gastrulas appartenant à la même espèce (Pleurodèles). Nous avons observé une pénétration massive du glycocolle dans l’explantat de la lèvre dorsale du blastopore. Les embryons greffés ont fourni de bonnes réponses morphogénétiques sous la forme d’inductions importantes, malgré la forte radioactivité du greffon. Celle-ci se retrouvait facilement par la méthode autoradiographique; en outre, il est apparu nettement que le système nerveux induit manifestait une radioactivité appréciable.

(b) Greffes hétéroplastiques

1. Détails techniques

Ces essais préliminaires ayant montré que l’expérience était techniquement possible, nous avons cherché à rendre la démonstration plus convaincante en travaillant sur des greffons et des hôtes d’espèces différentes, donc aisément reconnaissables. Les images autoradiographiques obtenues lors de ces expériences étant de loin les plus nettes, il importe de s’étendre un peu plus sur les détails expérimentaux de cette partie du travail.

(α) Greffes d’organisateurs de Rana fusca, marqués par la glycine-1-14C dans des gastrulas d’Axolotl. Des lèvres dorsales du blastopore de gastrulas de Rana fusca ont été disséquées et prélevées stérilement dans 5 c.c. d’une solution ainsi composée:

Les explantats, prélevés délicatement à la pipette, ont été placés pendant 3 heures dans 5 c.c. de la même solution, mais additionnée de 05 μM./c.c. de glycine-l-14C, dont toutes les molécules étaient marquées.

L’incubation a été suivie d’un lavage soigneux, à 3 reprises, dans le même milieu contenant, cette fois, du glycocolle non radioactif.

La greffe des organisateurs marqués de Rana a été effectuée dans le blastocèle de jeunes gastrulas d’Axolotl; les précautions usuelles d’asepsie ont été observées rigoureusement.

Une heure après l’opération, le milieu stérile concentré a été remplacé par le même milieu, dilué au dixième.

Les embryons opérés ont été maintenus à 18° pendant 2 ou 3 jours, puis fixés à l’alcool acétique (3:1) pendant 1 heure. Après lavage à l’alcool 70°, ils ont été enrobés et coupés à 10/x d’épaisseur sur des lames gélatinées.

Les coupes ont alors été recouvertes d’émulsion photographique (G5 Ilford ‘in gel form’) suivant la technique habituelle.

Après 3 à 6 jours d’exposition en chambre noire, les préparations ont été développées, fixées et colorées à travers la gélatine par la méthode de Unna.

Pour distinguer la radioactivité de la glycine incorporée respectivement par les protéines et par les acides nucléiques, une série de coupes alternantes ont été hydrolysées par de l’HCl normal pendant 5 minutes à 60°, suivant la méthode de Vendrely (1946).

Enfin, pour éliminer plus spécifiquement l’activité imputable à l’acide ribonu-cléique, une autre série de coupes a été traitée à la ribonucléase selon la méthode de Brachet (1942).

L’existence possible, dans les préparations de ribonucléase cristallisée, d’enzymes protéolytiques qui pourraient rendre cette réaction cytochimique moins spécifique et attaquer la gélatine de l’émulsion photographique, nous a conduite à la purifier selon la méthode de MacDonald (1948): 5 c.c. d’une solution à L25 pour cent de ribonucléase, cristallisée selon la méthode de Kunitz (1950), dans du sulfate d’ammonium Cl / 5 de la saturation) ont été ajustés à pH 3 0 avec de l’acide sulfurique N. Après avoir été portée à l’ébullition au bain-marie, pendant 5 minutes, la solution a été brusquement refroidie et maintenue à - 5° C. pendant 1 heure. Le précipité a été éliminé par une centrifugation brève et la solution a été mise à dialyser contre de l’eau courante pendant 5 heures.

Un tel traitement inhibe complètement l’activité protéolytique et il laisse à la ribonucléase une activité enzymatique de 92 pour cent.

L’incubation des lames dans la solution de ribonucléase ainsi purifiée a été effectuée pendant 1 heure à 37°. A ce moment, les lames ont été lavées soigneuse-ment dans de l’eau distillée, de même d’ailleurs que celles qui avaient été soumises à l’hydrolyse acide; elles ont été ensuite recouvertes d’émulsion photographique.

Enfin, afin de s’assurer que la technique opératoire n’altère pas le pourcentage et la qualité des inductions, quelques implantations d’organisateurs dans des embryons témoins ont été effectuées; dans ces témoins, le traitement à la glycine radioactive était remplacé par un traitement à la glycine non marquée.

(β) Greffes d’organisateurs de Rana fusca, marqués par l’acide orotique- 2-I4C-6 car boxy lique, dans des gastrulas d’Axolotl. Une autre série d’expériences a été effectuée sur le même matériel et dans des conditions analogues; mais l’organisateur a été marqué, cette fois, par de l’acide orotique-2-14C dont l’activité spécifique était de 40,000 c./minute/mgr. On sait que cette substance est un précurseur très spécifique de l’acide ribonucléique (Hurlbert & Potter, 1952).

Comme on est malheureusement limité par la faible solubilité de cette substance (elle n’est que de 50y/c.c.) l’activité totale du milieu n’était que de 20,000 c. / minute, au lieu de 450,000 dans l’expérience précédente.

Le milieu d’incubation a été naturellement ajusté à pH 7 0 après addition de l’acide orotique.

Les durées de traitement par l’acide orotique marqué, les lavages et tous les détails techniques ultérieurs étaient les mêmes que dans l’expérience précédente.

Dans ce cas encore, une série de coupes alternantes à été soumise à l’action de la ribonucléase, dans les mêmes conditions que lors de l’expérience ci-dessus.

Enfin, les témoins ont consisté en l’implantation, dans des gastrulas d’Axolotl, d’organisateurs de Rana fusca traités par une solution d’acide orotique non marqué.

(γ) Expériences d’explantation. Des organisateurs d’Axolotl, qui avaient été prélevés et traités exactement comme dans les expériences précédentes, ont été marqués par de la glycine-l-i4C, puis accolés à de l’ectoblaste, soit d’Axolotl, soit de Rana temporaria.

Toutes les précautions décrites plus haut ont été observées à nouveau pour garantir la stérilité des opérations et pour empêcher toute contamination par l’élément radioactif.

Dans une seconde série d’expériences, de l’ectoblaste de Rana temporaria marqué à la glycine-l-i4C a été accolé à des organisateurs normaux d’Axolotl non marqués.

Enfin, des témoins ont été effectués en utilisant de la glycine non radioactive pour les deux séries d’expériences.

A titre de contrôle biochimique, des explantats préalablement bouillis ont été traités par la solution radioactive dans les mêmes conditions que les explantats vivants; ils ont été ensuite fixés, coupés et recouverts d’émulsion photographique afin de vérifier si la radioactivité observée ne pouvait être due, en partie, à des phénomènes d’adsorption.

2. Résultat des expériences

(α) Les organisateurs qui ont été marqués par de la glycine-l-14C, puis implantés dans des blastulas, montrent sur coupes une radioactivité intense du greffon.

Dans les cas positifs (50 pour cent), une activité appréciable se manifeste aussi dans le système nerveux induit et dans la chorde, quand celle-ci s’est différenciée; cette activité est très nettement localisée dans les noyaux (Planche 1, fig. A). Une activité moindre s’observe aussi dans le système nerveux primaire; en général, on retrouve des traces d’électrons dans toutes les régions de l’embryon où la morphogénèse est active (Planche 2, fig. C).

Dans les cas où le greffon s’est autodifférencié, il présente une activité intense, dans la chorde notamment.

Dans les coupes hydrolysées par l’HCl pendant 5 minutes à 60°, une diminution de la radioactivité, qui atteint 50 pour cent de la valeur initiale, s’observe tant dans le greffon que dans les organes en voie de formation.

Enfin, l’autoradiographie des préparations traitées à la ribonucléase accuse une diminution de 32 pour cent des traces.

On peut en conclure que, lors de l’hydrolyse par l’HCl, 18 pour cent des traces éliminées proviennent des bases puriques de l’acide désoxyribonucléique et, peut-être, d’une petite fraction protéique. Ce résultat se retrouve aisément lorsqu’on traite les coupes par la ribonucléase d’abord, puis par l’HCl N à 60°, pendant 5 minutes.

L’observation des coupes des embryons témoins a montré que le pourcentage des inductions est voisin de celui qu’on obtient dans les expériences faites avec les organisateurs marqués. L’étude de ces témoins permet, en plus, de déterminer la valeur du back-ground, qui a été déduite dans le tableau 1.

TABLEAU 1

Répartition de la radioactivité dans les différents régions d’embryons présentant une induction

Répartition de la radioactivité dans les différents régions d’embryons présentant une induction
Répartition de la radioactivité dans les différents régions d’embryons présentant une induction

Ces chiffres sont tirés de l’observation des coupes de 8 embryons, qui présentaient tous de belles inductions. Le nombre total des traces comptées est, malheureusement, insuffisant pour donner au résultat une réelle valeur statistique; il ne fait cependant pas de doute que le phénomène observé soit significatif.

Il nous a été malheureusement impossible de calculer la radioactivité spécifique des protéines et des acides nucléiques, en raison de la complexité excessive du matériel.

(β) Dans le cas des organisateurs marqués par l’acide orotique, l’incorporation dans le greffon est sensiblement moindre que dans celui de la glycine; mais une nette radioactivité se retrouve à nouveau dans toutes les régions où la mor-phogénèse est active; les noyaux sont particulièrement actifs et on y remarque assez souvent des traces émises par les nucléoles. Quelques électrons épars s’observent cependant entre les plaquettes vitellines (Planche 2, fig. D).

Lorsque des coupes de cette série sont soumises à l’action de la ribonucléase, elles présentent une radioactivité du même ordre de grandeur que le background: l’incorporation, dans ce cas, se produit donc spécifiquement dans l’acide ribonucléique.

L’observation des coupes d’embryons témoins conduit aux mêmes conclusions que dans le cas de la glycine; l’incubation dans le milieu marqué par l’acide orotique ne semble pas inhiber sensiblement le pouvoir inducteur de l’organisateur. C’est l’observation des coupes de cette série qui nous a permis, à nouveau, de mesurer le back-ground.

(γ) Dans le cas des explantats soumis à l’action de la glycine radioactive, on observe à nouveau une forte radioactivité dans les noyaux du fragment traité; on note, en outre, une diffusion modérée de la glycine vers l’ectoblaste ou le neuroblaste accolés (Planche 1, fig. B).

Toutefois, nous n’avons pas obtenu, dans ces conditions, de réponses morphologiques nettes, même dans le cas des témoins où l’explantat n’était pas radioactif.

Les coupes traitées à la ribonucléase et à l’HCl N à 60° pendant 5 minutes ont montré des diminutions d’activité dans les explantats analogues à celles qui ont été observées dans le cas des embryons entiers.

Enfin, il semble que l’acide orotique et la glycine libres soient totalement éliminés des greffons par les lavages effectués avec ces substances non marquées et par la fixation: en effet, des fragments bouillis, qui ont été traités de la même manière que les embryons en expérience, ne présentent qu’une radioactivité tout à fait négligeable, conformément d’ailleurs aux résultats de Friedberg & Eakin (1949).

L’analyse par autoradiographie des greffes d’organisateurs marqués confirme les résultats que Brachet (1949) avait obtenus en étudiant la migration de granules colorés au rouge neutre au cours de l’induction; elle est en accord aussi avec les données de MacKeehan (1951) et de De Vincentiis (1952) qui ont pu empêcher l’induction du cristallin en l’isolant de la cupule optique par des membranes de porosités variables; elle cadre, enfin, avec les résultats plus anciens de Holtfreter (1948) qui a montré qu’un organisateur enveloppé dans une mem-brane vitelline est incapable d’induire et de Brachet (1950) qui a obtenu des effets comparables en interposant une membrane en cellophane entre l’organisateur et le réacteur.

L’autoradiographie présente un net avantage sur la coloration vitale, puisqu’elle permet de suivre les constituants naturels de l’organisateur (protéines, acides nucléiques) au lieu d’un colorant basique, qui risque d’être toxique; elle se montre aussi, croyons-nous, plus favorable que les mesures au compteur de Geiger auxquelles Waddington (1950) a recouru: en effet, afin d’obtenir une activité mesurable et d’arriver à séparer le greffon de l’ectoblaste, Waddington a dû utiliser, comme implantât, une suspension de levures traitées par du 32P, puis tuées. La technique autoradiographique permet, au contraire, de travailler sur l’organisateur vivant. Comme l’a souligné Brachet (1945), le mécanisme biochimique des évocations provoquées par des inducteurs hétérogènes (les levures tuées de Waddington, par exemple) n’est pas nécessairement le même que celui de l’induction normale.

Le glycocolle et l’acide orotique libres étant vraisemblablement éliminés lors du lavage, de la fixation et de l’enrobage, on peut attribuer la radioactivité observée dans les autoradiographies à des substances de poids moléculaire élevé, qu’il s’agisse d’acides nucléiques ou de protéines. Il se pourrait dès lors que l’organisateur laisse diffuser de telles substances dans les organes qu’il induit; mais il importe cependant de noter que la radioactivité ne se retrouve pas exclusivement dans ces derniers, puisque les organes axiaux de l’hôte sont, quoiqu’à un degré moindre, actifs aussi. On ne peut exclure la possibilité que cette activité résulte d’une destruction de certaines cellules du greffon, avec libération d’acides aminés ou de pyrimidines, qui diffuseraient dans la totalité de l’hôte et y seraient réincorporés dans les régions où la morphogénèse est la plus active.

Des expériences récentes de Niu & Twitty (1953) et de Grobstein (1953) semblent montrer d’ailleurs que certaines inductions peuvent se produire sans qu’il y ait de contact direct entre le chordomésoblaste et l’ectoblaste.

Il nous reste à examiner sommairement quelle est la nature chimique des molécules actives et à discuter leur localisation intracellulaire.

En ce qui concerne les embryons traités par l’acide orotique, nous avons vu qu’un traitement par la ribonucléase réduit l’activité au niveau du back-ground, la radioactivité observée est donc le fait du seul acide ribonucléique; il en est ainsi tant dans le cytoplasme que dans le noyau; c’est dans ce dernier que la radioactivité est la plus élevée, en raison sans doute d’un métabolisme particulièrement actif des nucléoles. Ces données cadrent parfaitement avec celles que Hurlbert & Potter (1952) ont obtenues dans le cas du foie de Mammifères: pour ces auteurs aussi, l’acide orotique serait un précurseur hautement spécifique de TARN et le noyau se montrerait beaucoup plus actif que le cytoplasme.

L’interprétation des expériences faites avec de la glycine marquée est beaucoup plus complexe: nous avons vu qu’une hydrolyse par l’HCl N, pendant 5 minutes à 60°, diminue de 50 pour cent la radioactivité dans les différentes zones de l’embryon; un traitement à la ribonucléase respecte 68 pour cent de l’activité initiale. Nous avons donc attribué 18 pour cent des traces à l’acide désoxyribonucléique et à une éventuelle fraction protéique labile; 32 pour cent de l’activité seraient donc imputables à l’acide ribonucléique.

En ce qui concerne l’incorporation de la glycine dans les acides nucléiques, nos résultats sont en bon accord avec les observations biochimiques de Smellie, Maclndoe, & Davidson (1953). Selon ces auteurs, qui ont travaillé sur des homo-génats de foie, la glycine iSN, tout comme le 32P et le formiate 14C d’ailleurs, s’incorpore beaucoup plus intensément dans l’acide ribonucléique que dans l’acide désoxyribonucléique.

Quant à l’incorporation de la glycine dans les protéines des embryons, elle représente 50 pour cent du phénomène total, si on fait abstraction des protéines labiles, dont l’importance demeure incertaine. Les traces, dans le cas des embryons, proviennent en majorité des noyaux: un dénombrement de ces traces donne un rapport de 5:2 en faveur de ces derniers. Le traitement à la ribonucléase semble respecter ce rapport, de même d’ailleurs que l’hydrolyse par HCl N: les protéines éliminées par cette hydrolyse, si elles existent, ne seraient donc pas particulièrement actives.

Daly et ses collaborateurs (1952) ont étudié l’incorporation de la glycine-15N dans les constituants chimiques des noyaux isolés: elle est faible dans l’acide désoxyribonucléique, plus marquée dans l’histone et beaucoup plus élevée dans les protéines résiduelles; dans ces dernières, elle devient comparable à celle du cytoplasme global. Ces auteurs font remarquer qu’à une intense activité cytoplasmique correspond toujours une très forte activité nucléaire. C’est à des résultats assez voisins qu’ont abouti aussi Smellie, Maclndoe, & Davidson (1953) qui ont utilisé également la glycine-15N.

Nos résultats ne peuvent donc être comparés directement avec ceux des biochimistes, qui ont utilisé un autre précurseur que nous; en outre il convient de faire remarquer qu’aucune expérience sur l’incorporation d’un acide aminé marqué n’a été effectuée sur des noyaux isolés en milieu non aqueux, selon la méthode de Behrens (1938); or le traitement par l’acide citrique, qui a toujours été employé jusqu’à présent dans les expériences sur l’incorporation d’isotopes, s’accompagne d’une perte importante des protéines (Allfrey et al., 1952). Il n’est donc nullement impossible que l’acide citrique élimine des protéines particulièrement actives. Il serait particulièrement intéressant de traiter par de l’acide citrique dilué des coupes fixées au freezing-drying pour voir si on n’élimine pas ainsi des protéines nucléaires fortement radioactives.

L’analyse de l’induction neurale, au moyen d’organisateurs marqués à la glycine et à l’acide orotique a permis de mettre en évidence la migration des substances radioactives lors de la neuralisation.

L’incorporation des précurseurs est la plus considérable dans les régions en voie de morphogénèse active, tant en ce qui concerne les protéines que les acides nucléiques. Elle semble être particulièrement intense dans les noyaux.

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PLANCHE 1

FIG. A. Deux électrons du 14C émis par le noyau d’une cellule embryonnaire.

FIG. B. Coupe dans un explantat; le fragment fortement radioactif (organisateur d’Axolotl) est accolé à de l’ectoderme de Rana temporaria.

PLANCHE 1

FIG. A. Deux électrons du 14C émis par le noyau d’une cellule embryonnaire.

FIG. B. Coupe dans un explantat; le fragment fortement radioactif (organisateur d’Axolotl) est accolé à de l’ectoderme de Rana temporaria.

PLANCHE 2

FIG. C. Répartition de la radioactivité dans un embryon d’Axolotl présentant une induction. Le greffon (Rana fusca) fortement radioactif est marqué à la glycine-l-14C.

FIG. D. Répartition de la radioactivité dans un embryon d’Axolotl présentant une induction. Le greffon (Rana fusca) est marqué à l’acide orotique-2-14C.

PLANCHE 2

FIG. C. Répartition de la radioactivité dans un embryon d’Axolotl présentant une induction. Le greffon (Rana fusca) fortement radioactif est marqué à la glycine-l-14C.

FIG. D. Répartition de la radioactivité dans un embryon d’Axolotl présentant une induction. Le greffon (Rana fusca) est marqué à l’acide orotique-2-14C.