A preliminary description is given of the submicroscopic texture of the yolk platelets and of the membrane which surrounds them, as also of that of the hyaloplasm.

The ultrastructure of the cytoplasm of neurectoblast cells and of ventral epiblast cells from young neurulas is characterized by an obvious dorso-ventral orientation of the constituents (hyaloplasm and yolk platelets).

After treatment with urea these cells no longer show this orientation, and they then resemble normal ectoblast cells, but of a younger stage, at the beginning of gastrulation.

The modifications of ultrastructure are correlated with modifications of competence. The origin of these morphological and functional modifications is discussed.

Les expériences de J. W. Jenkinson (1906) ont montré que l’exposition des embryons de Grenouille à l’action de solutions d’urée provoque une altération profonde du développement ontogénétique, en particulier par la formation d’îlots chordaux au sein des organes voisins de la chorde dorsale. Reprenant dans un travail récent ces expériences, J. Fautrez (1951) interprète le phénomène mentionné comme étant le résultat d’une diffusion de substances cytospécifiques, de la chorde dorsale vers les cellules atteintes. Cette diffusion de substances normalement peu ou pas diffusibles serait rendue possible par des modifications de perméabilité cellulaire provoquées par l’urée. En effet, l’action perméabilisante de l’urée est connue de longue date. Il est intéressant de noter que dans une étude récente F. Seemann (1953) arrive à la conclusion opposée: l’urée diminuerait la perméabilité cellulaire à l’eau. Il est à remarquer pourtant que le seul critère de la perméabilité adopté par cet auteur est la vitesse d’apparition et de disparition des phénomènes plasmolytiques dans les cellules végétales, ce qui nous paraît être une base trop étroite pour une étude du processus complexe de la perméabilité cellulaire. D’autre part cependant, Seemann arrive à la conclusion que L. Monné (1947) a tiré de ses recherches, à savoir que l’urée altère profondément la structure de toute la masse cytoplasmique de la cellule.

Il est bien connu que le feuillet externe des embryons d’Amphibiens n’est susceptible de réagir à l’action de l’inducteur que pendant une période déterminée et assez brève de son évolution. Cette réceptivité de Fectoblaste est nommée ‘compétence’. Partant de l’hypothèse que la disparition progressive des compétences cérébrogènes et sensorielles de Fectoblaste est due, au moins partiellement, à une diminution progressive de la perméabilité de Fectoblaste aux substances inductrices, J. Gallera (1953) a récemment effectué deux séries d’expériences sur les embryons de Triton: dans la première Fectoblaste ventral des embryons normaux a été transplanté sur la voûte archentérique de jeunes neurulas, dans la seconde série les greffons ont été prélevés chez des embryons traités préalablement par un mélange composé de solution de Holtfreter et de solution d’urée (1 volume de la solution de Holtfreter + 3 volumes d’urée à 1 pour cent). Le résultat de ces expériences a été très net: Les transplantais prélevés au début de la neurulation d’embryons élevés dans des conditions normales n’ont plus été aptes à construire du cerveau ni des organes des sens. Par contre, les greffons du même âge excisés chez des embryons cultivés durant toute la gastrulation dans la solution de Holtfreter additionnée d’urée ont été encore capables de bâtir un cerveau plus ou moins bien développé et les organes des sens correspondants.

Le problème que nous nous sommes posé dans le travail présent est de savoir quelles modifications apparaissent au cours de la gastrulation dans la structure cytoplasmique du feuillet externe, et d’autre part quelles sont les altérations de cette structure provoquées par l’urée.

Nous avons étudié à l’aide du microscope polarisant et du microscope électronique des coupes de l’ectoblaste de Pleurodeles Waltlii prélevé sur des embryons normaux ou traités par l’urée.

Les embryons soumis à l’action de la solution d’urée à 0 · 75 pour cent sont cultivés dans ce milieu sans membrane vitelline, du stade de l’encoche blastoporale jusqu’au début de la neurulation, soit 29 heures. Dans ces conditions, l’invagination et l’extension de l’ectoblaste dorsal sont partiellement arrêtées: au moment de l’apparition du sillon médian et du liséré pigmenté, le blastopore est encore largement ouvert et muni d’un gros bouchon vitellin. Il est à mentionner que la distribution du pigment est fréquemment très irrégulière, les embryons étant comme tachetés. Malgré cette altération profonde du développement général, les greffons prélevés sur ces embryons et transplantés sur les neurulas normales peuvent se développer parfaitement.

De petits rectangles d’ectoblaste dorsal et ventral sont prélevés sur de jeunes gastrulas au stade de l’encoche blastoporale, et sur des embryons au début de la neurulation. Cet ectoblaste est fixé soit au formol (1 volume de formol+ 4 volumes de mélange tampon), soit à l’acide osmique à 1 pour cent tamponné. 11 est important pour le maintien des structures submicroscopiques que le pH du fixateur soit le même que celui du matériel fixé, comme l’a montré C. A. Baud (1953b). En ce qui concerne les Urodèles, on ne trouve dans la littérature que les résultats des mensurations du pH intracellulaire faites par F. J. J. Buytendijk & M. W. Woerdeman (1927) sur le Triton taeniatus. D’après ces auteurs le pH de l’ectoblaste de la gastrula est 7 · 6 et celui de la neurula de 6 · 9 à 7 · 0. Nos fixateurs sont tamponnés à 7 · 4 quand il s’agit de gastrulas et à 6 · 7 dans le cas des neurulas. Après une fixation de 24 heures, puis un passage très progressif par les alcools, l’inclusion est faite soit dans la paraffine soit dans la celloïdine-paraffine.

Les blocs ectoblastiques fixés au formol et inclus dans la paraffine sont coupés longitudinalement; les coupes de 4 μ d’épaisseur sont posées alternativement sur deux lames porte-objet: l’une est montée directement dans le Cedax, tandis que l’autre est préalablement colorée dans le mélange de pyronine et de vert de méthyle tamponné à 4 · 66.

Les coupes ultraminces (environ 0 · 1 μ d’épaisseur), également longitudinales, destinées à l’étude au microscope électronique, sont faites avec le matériel fixé à l’acide osmique et inclus dans la celloïdine-paraffine.

L’observation des biréfringences, qui nécessite un microscope polarisant spécial muni d’un compensateur très sensible, se fait suivant la méthode antérieurement décrite par C. A. Baud (1948).

(a) Étude des constituants fondamentaux des cellules ectoblastiques

Nos observations ont porté sur trois constituants des cellules ectoblastiques: le hyaloplasma, les plaquettes vitellines et les grains de pigment.

Le hyaloplasma présente dans certains cas, que nous indiquerons plus loin, une orientation des molécules protéiques de sa charpente. Cette disposition régulière, perpendiculaire à la surface de l’ectoblaste, se manifeste dans les préparations fixées et montées, par une légère biréfringence des travées hyaloplasmiques, positive par rapport à l’allongement de ces formations. Cette biréfringence, parfaitement reconnaissable sous le microscope polarisant, n’est malheureusement pas suffisamment forte pour apparaître nettement sur les microphotographies. Pour cette raison, des dessins légèrement schématisés sont joints à nos photos B et C; les stries cytoplasmiques biréfringentes sont marquées dans nos dessins par de minces traits noirs.

On connaît depuis longtemps la biréfringence du cytoplasme au tout premier stade du développement (voir à ce sujet en particulier le travail d’ensemble de W. J. Schmidt, 1941, et A. M. Dalcq, 1951). A des stades plus avancés, C. H. Waddington (1940,1942) a observé une biréfringence du cytoplasme des cellules en bouteille qui s’invaginent au niveau de l’encoche blastoporale. Chez de jeunes embryons de Poulet, L. B. Hobson (1941), examinant in vivo sous le microscope polarisant la plaque et le tube neural, a pu constater que les membranes cellulaires et peut-être aussi le cytoplasme montrent une légère biréfringence positive par rapport au grand axe des cellules. Par contre R. G. Harrison, W. T. Astbury, & K. M. Rudall (1940) n’ont noté dans les gastrulas et les neurulas que la biréfringence des membranes cellulaires.

Les plaquettes vitellines, qui sont de forme ovale, sont biréfringentes négatives par rapport à leur allongement; elles sont en réalité constituées d’un empilement de bâtonnets biréfringents positifs, disposés perpendiculairement au grand axe des plaquettes. Chaque plaquette est entourée d’une mince membrane, biréfringente négative par rapport à la normale à la surface (Planche, fig. B); cette anisotropie optique est semblable à celle de la membrane nucléaire (cf. C. A. Baud, 1953a), et correspond de même à une texture submicroscopique foliaire de ses constituants protéiques. Tandis que cette biréfringence de la membrane n’a jamais été observée jusqu’ici, celle de la plaquette vitelline elle-même a fait l’objet de mentions de la part de L. Radlkofer (1859), W. J. Schmidt (1924), et J. Holtfreter (1946b).

Les grains de pigment sont également visibles entre les niçois croisés, comme de minuscules taches brillantes arrondies; mais il s’agit ici d’une ‘fausse biréfringence’ (cf. C. A. Baud, 1953c) due aux phénomènes de réflexion totale de la lumière à l’interface entre les grains et le milieu qui les entoure. D’ailleurs, seuls les grains de mélanine de forme allongée peuvent être biréfringents, comme l’a montré W. J. Schmidt (1949). Au microscope électronique, les grains de pigment apparaissent effectivement sphériques dans notre matériel (Planche, fig. E).

(b) Étude expérimentale de l’ultrastructure des cellules ectoblastiques

Ectoblaste au début de la gastrulation

Les cellules du neurectoblaste présomptif, dont l’épaisseur atteint 120 μ environ (Planche, fig. A), sont fortement allongées dans le sens dorso-ventral; leur face externe est légèrement bombée. Tout le corps cellulaire, sauf la couche corticale ou ‘coat’ de Holtfreter dont la zone profonde est farcie de grains de pigment, est rempli de plaquettes vitellines; sous le cortex on voit de petites plaquettes; dans les couches plus profondes, de petites et de grosses plaquettes sont mélangées sans ordre apparent. Les grains de pigment descendent le long des cloisons intercellulaires, souvent jusqu’à la face profonde de Fectoblaste. Les minces travées cytoplasmiques qui séparent les plaquettes vitellines ont un aspect hyalin; aucune biréfringence n’y est détectable.

Ectoblaste normal d’une jeune neurula.

La face externe du neurectoblaste et de l’épiblaste ventral est régulière et lisse. Les grains de pigment sont limités à la zone profonde de la couche corticale, et pénètrent plus ou moins profondément le long des cloisons intercellulaires. Les grosses plaquettes vitellines sont rassemblées dans la région basale des cellules. La plupart de ces plaquettes sont orientées avec leur grand axe parallèle à la face interne de Fectoblaste; en revanche, les plaquettes situées plus superficiellement sont fréquemment orientées, surtout les petites, perpendiculairement à la surface, en formant de petits chapelets biréfringents négatifs.

La quantité de plaquettes vitellines, aussi bien dans le neurectoblaste que dans l’épiblaste ventral, est nettement diminuée par rapport à celle que l’on a constatée dans Fectoblaste plus jeune. De larges plages de cytoplasme pur apparaissent entre les plaquettes vitellines. Dans le neurectoblaste, dont les cellules sont fortement allongées, ces plages occupent le tiers supérieur environ du corps cellulaire. Dans l’épiblaste ventral, aux cellules plus ou moins cubiques, la localisation de ces plages cytoplasmiques est moins régulière. Le cytoplasme est nettement orienté dans le sens dorso-ventral; au sein des plages mentionnées on voit des pinceaux de filaments biréfringents positifs; on peut aussi apercevoir ces filaments dans les travées cytoplasmiques entre les plaquettes vitellines. L’orientation des grains de pigment en colonnettes verticales prouve que le cytoplasme superficiel a aussi une texture orientée. Il convient de souligner que cette texture orientée du cytoplasme est aussi bien visible dans le neurectoblaste (Planche, fig. B) que dans l’épiblaste ventral (Planche, fig. C); nous avons donc affaire à une modification générale de la structure cytoplasmique de l’ectoblaste. En particulier, c’est une modification complètement indépendante du processus d’allongement des cellules constituant la plaque neurale.

Ectoblaste des neurulas traitées préalablement par l’urée.

Le neurectoblaste est plus épais et plus riche en plaquettes vitellines que celui des embryons normaux; l’épaisseur de ce dernier est de 44 μ environ, tandis que le neurectoblaste des embryons traités par l’urée atteint 70 μ. L’épaisseur anormale est la conséquence de l’inhibition partielle de l’extension de l’ectoblaste durant la gastrulation; la richesse en plaquettes vitellines est le résultat de l’arrêt de l’invagination, la plaque neurale étant constituée par un matériel plus postérieur que dans le cas du développement normal. Par conséquent, les plages de cytoplasme pur sont moins nombreuses et moins étendues que dans l’ectoblaste d’embryons normaux du même âge. Cependant, le fait le plus intéressant est que ce cytoplasme a un aspect nettement homogène, sans trace de filaments biréfringents; il n’y a pas non plus d’orientation des plaquettes vitellines. Il est à remarquer que de grosses plaquettes vitellines sont fréquemment situées directement sous le cortex (Planche, fig. D). D’autre part la disposition des grains de pigment est fort irrégulière (Planche, fig. D, à gauche).

La couche corticale est par endroits profondément altérée; c’est ce que montre l’observation au microscope électronique. Sur la coupe représentée à gauche de notre figure E de la Planche, le cortex a l’aspect normal et se présente sous la forme d’une mince couche plus homogène que le cytoplasme sous-jacent; on voit une cloison intercellulaire, et il est intéressant de noter qu’à ce niveau, contrairement à l’opinion de J. Holtfreter (1943, 1944, 1946a), la couche corticale est interrompue; nous avons observé le même phénomène dans plusieurs préparations. Sur la coupe figurée à droite de notre figure E, la structure caractéristique de la couche corticale est entièrement effacée sous l’action de l’urée.

L’ectoblaste embryonnaire ne prend l’aspect nettement épithélial que vers la fin de la gastrulation. Ce phénomène a peut-être pour conséquence une polarisation plus marquée des courants de diffusion de substances à travers les cellules, les surfaces d’échange se trouvant réduites. Cette polarisation, d’après les conceptions de A. W. Pollister (1941), serait à l’origine de l’orientation parallèle des chaînes moléculaires protéiques du hyaloplasma. Cette supposition semble renforcée par le fait que la plaque neurale de l’embryon traité par l’urée, bien que parfaitement identifiable par son relief, est composée de cellules moins allongées et à limites plus arrondies que celles de l’embryon normal, et ne présentant pas de hyaloplasma orienté biréfringent.

Les cellules ectoblastiques des neurulas traitées par l’urée présentent sensiblement le même aspect que les cellules ectoblastiques normales, mais plus jeunes, du début de la gastrulation, en particulier en ce qui concerne l’absence de hyaloplasma orienté biréfringent. Or nous savons que les transplants de l’ectoblaste âgé, mais traité par l’urée, se comportent à peu près de la même façon que ceux de l’ectoblaste normal plus jeune. Les modifications de l’ultrastructure se superposent donc aux modifications de compétence.

La texture non orientée de cet ectoblaste traité par l’urée semble d’autre part indiquer qu’il a gardé encore toute sa perméabilité primitive. En tous cas l’examen à l’aide du microscope électronique a montré que la structure de la couche corticale est profondément bouleversée. D’autre part, la présence de grosses plaquettes vitellines directement sous le cortex et la disposition irrégulière du pigment semblent indiquer que ce bouleversement a atteint tout le corps cellulaire.

La texture submicroscopique des plaquettes vitellines et de la membrane qui les entoure fait l’objet d’une description préliminaire, ainsi que celle du hyaloplasma.

L’ultrastructure du cytoplasme des cellules du neurectoblaste et de l’épiblaste ventral de jeunes neurulas est caractérisée par une nette orientation dorso-ventrale des constituants (hyaloplasma et plaquettes vitellines).

Après traitement par l’urée, les mêmes cellules ne présentent plus cette orientation, et ressemblent alors aux cellules ectoblastiques normales mais plus jeunes du début de la gastrulation.

Les modifications de l’ultrastructure se superposent aux modifications de compétence. L’origine de ces modifications morphologiques et fonctionnelles est discutée.

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Embryons de Pleurodeles Waltlii. Coupes longitudinales.

FIG. A. Ectoblaste dorsal au début de la gastrulation. Coupe de 4 μ d’épaisseur, colorée dans le mélange de pyronine et de vert de méthyle. Microphotographie en contraste de phase positif. Grossissement 490 ×.

FIG. B. Plaque neurale au stade du liséré pigmenté. Coupe de 4 μ d’épaisseur. Nicols croisés (direction de vibration des nicois à 45° par rapport aux bords de l’image), compensateur de K ö hler interposé et orienté de telle façon que les structures observées sont en position d’addition (claires) lorsque la direction de leur grand indice est parallèle au bord inférieur de l’image. A gauche, schéma explicatif montrant le hyaloplasma orienté (en traits fins), les plaquettes vitellines et leurs membranes, et au centre un noyau de forme caractéristique. Grossissement 910 x.

FIG. C. Épiblaste ventral d’un embryon du même âge que celui de la figure précédente, et photographié dans les mêmes conditions. A gauche, schéma explicatif. Grossissement 910 ×.

FIG. D. Plaque neurale au stade du liséré pigmenté, chez un embryon traité par l’urée. Conditions d’observation comme dans la figure 1. Grossissement 490 ×.

FIG. E. Plaque neurale au stade du liséré pigmenté, chez un embryon traité par l’urée. Coupes de 0 · 1 μ d’épaisseur. Micrographies électroniques, 7,250 ×. A remarquer: la forme arrondie des grains de pigment; à gauche, la couche corticale bien visible, avec la cloison intercellulaire qui l’interrompt; sur la figure de droite, la structure de la couche corticale est effacée.

FIG. A. Ectoblaste dorsal au début de la gastrulation. Coupe de 4 μ d’épaisseur, colorée dans le mélange de pyronine et de vert de méthyle. Microphotographie en contraste de phase positif. Grossissement 490 ×.

FIG. B. Plaque neurale au stade du liséré pigmenté. Coupe de 4 μ d’épaisseur. Nicols croisés (direction de vibration des nicois à 45° par rapport aux bords de l’image), compensateur de K ö hler interposé et orienté de telle façon que les structures observées sont en position d’addition (claires) lorsque la direction de leur grand indice est parallèle au bord inférieur de l’image. A gauche, schéma explicatif montrant le hyaloplasma orienté (en traits fins), les plaquettes vitellines et leurs membranes, et au centre un noyau de forme caractéristique. Grossissement 910 x.

FIG. C. Épiblaste ventral d’un embryon du même âge que celui de la figure précédente, et photographié dans les mêmes conditions. A gauche, schéma explicatif. Grossissement 910 ×.

FIG. D. Plaque neurale au stade du liséré pigmenté, chez un embryon traité par l’urée. Conditions d’observation comme dans la figure 1. Grossissement 490 ×.

FIG. E. Plaque neurale au stade du liséré pigmenté, chez un embryon traité par l’urée. Coupes de 0 · 1 μ d’épaisseur. Micrographies électroniques, 7,250 ×. A remarquer: la forme arrondie des grains de pigment; à gauche, la couche corticale bien visible, avec la cloison intercellulaire qui l’interrompt; sur la figure de droite, la structure de la couche corticale est effacée.