The formation of cytasters and the metabolism of nucleic acids and proteins in amphibian eggs treated with heavy water

  1. Amphibian eggs (Pleurodeles and Xenopus) form cytasters, which are made of astral fibres and probably centrioles, upon treatment with concentrated heavy water (D2O).

  2. A study of the importance of nucleic acid and protein synthesis for the formation of cytasters was undertaken; both precursors and inhibitors of these syntheses were used.

  3. It was found that D2O completely inhibits the synthesis of nuclear DNA. Hydroxyurea (an inhibitor of DNA synthesis) and X-rays do not inhibit the appearance of the cytasters, which is clearly independent of nuclear DNA replication.

  4. Actinomycin D, a classical inhibitor of RNA synthesis, has no effect on cytaster formation.

  5. Eggs treated with D2O incorporate 14C-leucine in the nucleus as well as in the cytoplasm, including the cytasters. However, puromycin, which inhibits protein synthesis, has no effect on the formation of cytasters in Pleurodeles and Xenopus eggs. Another inhibitor of protein synthesis, cycloheximide, prevents the formation of cytasters in the eggs of Pleurodeles but not in those of Xenopus.

  6. Mercaptoethanol also blocks the appearance of cytasters in the eggs of Pleurodeles without affecting those of Xenopus.

  7. The possible reasons for the discrepancies in the results obtained with different species are discussed.

L’apparition accidentelle de cytasters s’observe fréquemment dans des œufs en voie de maturation ou de segmentation. Il a été montré par Gross & Spindel (1960a, b) dans le cas des œufs d’oursins et par nous-mêmes (Van Assel & Brachet, 1966) dans celui des œufs d’amphibiens qu’il est possible d’obtenir, de façon reproductible, la formation de cytasters par l’immersion d’œufs vierges ou fraîchement fécondés dans de l’eau lourde (D2O) à forte concentration.

Dans notre précédent travail (Van Assel & Brachet, 1966), nous avons montré que les cytasters se forment au sein de l’hyaloplasme des œufs vierges ou fécondés. Dans le cas de ces derniers, l’apparition de cytasters, par addition de D2O, s’accompagne toujours d’un arrêt extrêmement rapide des mitoses: dans de l’eau lourde à 50%, l’arrêt se fait après une division complète; dans l’eau lourde pure, le blocage se produit pendant la mitose en cours. Les cytasters apparaissent tous simultanément; d’abord de très petite taille, ils grandissent peu à peu pour atteindre leur taille définitive en 1 h à 1 h 30’, suivant l’espèce. Ils régressent légèrement par report des œufs dans de l’eau.

Au microscope électronique, les cytasters sont formés de fibres astériennes semblables à celles présentes dans les asters mitotiques normaux. A plusieurs reprises, nous avons observé des centrioles au centre des cytasters.

La présence, dans les cytasters, de fibres astériennes et de centrioles pose le problème de leur origine. Se forment-ils de novo ou à partir d’éléments préexistants dans le cytoplasme des œufs vierges ou fécondés? Dans la première hypothèse, résultent-ils d’une synthèse de protéines dirigée par du DNA (nucléaire, cytoplasmique ou centriolaire) et des RNA messagers (m-RNA)? On sait, en effet, que l’appareil mitotique (asters et fuseaux) est formé quasi totalement de protéines, associées à environ 5% de RNA (Mazia & Dan, 1952; Mazia, 1955, 1961; Zimmerman, 1960; Sakai, 1966; Kane, 1967).

Le présent travail a eu pour objet d’apporter une réponse, tout au moins partielle, à ces diverses questions: nous avons étudié, lors de la formation de cytasters sous action de l’eau lourde, l’incorporation de précurseurs du DNA (thymidine) et des protéines (leucine). D’autre part, nous avons étudié les effets d’inhibiteurs des synthèses protéiques (puromycine, cycloheximide) et des synthèses des acides nucléiques (hydroxyurée, rayons X, actinomycine) sur la formation des cytasters. Enfin, les effets éventuels du mercaptoéthanol qui empêche la formation de l’appareil mitotique dans les œufs d’oursins (Mazia, 1958a, b; Mazia & Zimmerman, 1958) et de Batraciens (Limbosch-Rolin & Brachet, 1961) ont été également examinés.

Les expériences ont été réalisées sur des œufs de Pleurodeles waltlii et de Xenopus laevis. Les stades utilisés allaient de l’œuf indivis au stade 4 blasto-mères, qui est particulièrement favorable pour les expériences de micro-injections (les œufs sont beaucoup plus sensibles aux piqûres aux stades plus jeunes).

Après enlèvement de la gangue à la pince, les œufs étaient répartis en une série de lots comprenant des témoins maintenus dans de l’eau de la ville, des œufs traités à l’eau lourde pure (D2O: Norsk Hydro-Elektrisk Kvaelstofak-tieselskab, pureté: 99,7%), des œufs traités, dans de l’eau de la ville, par les inhibiteurs ou précurseurs des synthèses d’acides nucléiques ou de protéines et, enfin, des œufs soumis à la fois à l’action de l’eau lourde et des divers inhibiteurs ou précurseurs de ces synthèses.

Les œufs de Batraciens étant pratiquement imperméables à la puromycine, l’actinomycine, la thymidine-3H et la leucine-14C, ces diverses substances ont été introduites dans l’œuf par micro-injection à l’aide d’une fine aiguille de verre fixée sur une seringue commandée par un micromanipulateur. Le volume de solution injectée était de l’ordre de 0,1 μ 1 par œuf. Toutes les expériences de micro-injections ont été effectuées sur des œufs de pleurodèle, au stade 4 blastomères.

Les œufs injectés de thymidine-3El et de leucine-14C ont été placés, immédiatement après l’injection, soit dans de l’eau de la ville pour les témoins, soit dans de l’eau lourde pure pour les traités. Les œufs injectés de thymidine ont été fixés à l’aldéhyde glutarique à 3,25%, pendant 1 h 30’; ceux injectés de leucine ont été fixés par congélation-substitution. Tous ont ensuite été soumis à l’autoradiographie sur coupes, suivant la méthode décrite par Ficq (1961).

Les œufs injectés de puromycine ou d’actinomycine ont été incubés dans de l’eau de la ville pendant des temps variables, avant d’être soumis à l’action de l’eau lourde.

Les œufs traités par la cycloheximide, le mercaptoéthanol ou l’hydroxyurée ont été prétraités (ou non) par une solution aqueuse de ces inhibiteurs avant d’être placés dans une solution de ces mêmes inhibiteurs dans le D2O.

Enfin, des œufs irradiés aux rayons X dans de l’eau de la ville (doses de 500, 1.000, 5.000 ou 10.000 roentgens) ont été subdivisés, immédiatement après l’irradiation, en deux groupes dont l’un était soumis à l’action de l’eau lourde.

Les œufs bloqués par l’eau lourde, ainsi que les témoins, ont été fixés après un temps ne dépassant jamais 2 h (1 h 30’ à 2 h pour les pleurodèles, 1 h 15’ à 1 h 30’ pour les xénopes) au Zenker acétique. Après enrobage à la paraffine, les œufs ont été coupés à 10 μ d’épaisseur et colorés à l’Unna ou au bleu de toluidine.

Formation de cytasters en présence de précurseurs et d’inhibiteurs de la synthèse des protéines

Incorporation de leucine-14C dans des œufs de pleurodèle traités à l’eau lourde

Les œufs de pleurodèle, au stade 4 blastomères, ont été injectés de 0,1 μI de leucine-14C à la concentration de 0,04 mg/ml (radioactivité spécifique de 165 me/ HIM). Une partie des œufs injectés a été maintenue dans de l’eau lourde pure, le restant se développant dans de l’eau de la ville. Les œufs ont été fixés 1 h 30’ à 2 h après l’injection; à ce moment, tous les œufs traités à l’eau lourde étaient bloqués au stade initial (4 blastomères).

L’examen des autoradiogrammes (planche 1, figs. A, B) montre que, tant dans les témoins que dans les traités au D2O, il y a un marquage de tout le cytoplasme et des noyaux; ce marquage n’est néanmoins pas identique d’un blastomère à l’autre, en raison sans doute d’une diffusion imparfaite de la leucine injectée.

Une accumulation des traces de grains d’argent se voit nettement au niveau des noyaux, tant chez les témoins que les traités.

Les cytasters sont visiblement marqués; mais il est difficile d’affirmer avec certitude que la radioactivité y soit plus forte que dans le restant du cytoplasme. On sait qu’il en va de même en ce qui concerne l’appareil mitotique des œufs d’oursins: il se marque certainement, après traitement des œufs par un acide aminé radioactif; mais la question de savoir s’il se marque davantage que le restant du cytoplasme demeure controversée (Gross & Cousineau, 1963; Bibring & Cousineau, 1964; Stafford & Iverson, 1964; Mangan, Miki-Noumura & Gross, 1965; Rinaldi, 1967; Wilt, Sakai & Mazia, 1967).

En tout état de cause, il est clair que le traitement par l’eau lourde des œufs de pleurodèle, dans les conditions qui donnent lieu à la formation de cytasters, n’inhibe pas les synthèses protéiques.

Injections de puromycine dans des œufs de pleurodèle traités par l’eau lourde

Legros & Brachet (1965) ont montré que de jeunes œufs de pleurodèle, après injection de puromycine, se bloquent après 6 à 7 h, c’est-à-dire en morula. L’étude de l’incorporation de leucine-14C leur a montré qu’il y a, au moment du blocage, une inhibition de la synthèse des protéines tant dans le noyau que le cytoplasme. Cet effet inhibiteur de la puromycine sur les synthèses protéiques commence déjà à se faire sentir, au niveau du cytoplasme, 3 h après l’injection.

En nous basant sur ces résultats, nous avons injecté des œufs de pleurodèle, au stade 4 blastomères, avec de la puromycine (200 μg/ml) et nous les avons laissés dans l’eau pendant des temps variant de 3 h à 5 h 30’. Après ces prétraitements, destinés à permettre à la puromycine d’inhiber la synthèse de protéines de manière plus ou moins importante, des lots d’œufs injectés ont été placés dans de l’eau lourde pure et fixés 1 h 30’ à 2 h plus tard.

Dans toutes ces expériences, quelle que soit la durée du prétraitement, il y a toujours eu formation de cytasters. Ce résultat indique que la formation de cytasters ne dépend pas d’une synthèse de novo de protéines.

Traitement d’œufs de pleurodèle et de xénope par de la cycloheximide et de l’eau lourde

Un autre inhibiteur de la synthèse des protéines, la cycloheximide, agit de façon différente pour empêcher la formation des liens peptidiques (Felicetti, Colombo & Baglioni, 1966). Dans les œufs de pleurodèle, la cycloheximide (100 à 200 μg/ml) bloque plus rapidement la synthèse de protéines (en 2 à 3 h) que ne le fait la puromycine; il en résulte un arrêt beaucoup plus rapide des mitoses (après une à deux divisions) (Legros, 1968).

Des œufs de pleurodèle (stade 4 blastomères) et de xénope (stade 4 et 8 blastomères) ont été prétraités par une solution de cycloheximide dans de l’eau (10 μg/ml) pendant des temps variant de 0 à 1 h (pleurodèles) et de 0 à 40 min (xénopes). Ces œufs ont été ensuite placés dans une solution d’eau lourde contenant 10 μg/ml de cycloheximide, pendant 1 h 30’ dans le cas des pleurodèles, 1 h à 1 h 15’ dans celui des xénopes.

L’examen cytologique des œufs de pleurodèle a montré que, dans le cas d’un prétraitement à la cycloheximide avant le traitement par le mélange d’eau lourde et de cycloheximide, les cytasters font défaut; par contre, les asters mitotiques normaux restent visibles. Au contraire, dans les œufs qui ont été traités uniquement par de la cycloheximide dans du D2O, les cytasters subsistent. Mais ils n’ont pas le même aspect que dans les œufs traités par l’eau lourde seule: ils sont beaucoup plus flous et se distinguent mal du restant du cytoplasme (planche 2, figs. C, D; planche 3, fig. E).

Mais les résultats sont entièrement différents dans le cas des œufs de xénope: quelle qu’ait été la durée du traitement en présence de cycloheximide, on observe toujours une formation normale de cytasters.

Planche 1

Fig. A. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle témoin, injecté de leucine-14C au stade 4 blastomères. Cytoplasme et appareil mitotique marqués, x 640.

Fig. B. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle injecté de leucine-14C au stade 4 blastomères et traité par l’eau lourde pure. Cytoplasme et cytasters marqués, x 640.

Planche 1

Fig. A. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle témoin, injecté de leucine-14C au stade 4 blastomères. Cytoplasme et appareil mitotique marqués, x 640.

Fig. B. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle injecté de leucine-14C au stade 4 blastomères et traité par l’eau lourde pure. Cytoplasme et cytasters marqués, x 640.

Planche 2

Fig. C. Œuf de pleurodèle (témoin des figs. D et E), traité par l’eau lourde seule au stade 4 blastomères, présentant de nombreux cytasters au pôle animal, x 160.

Fig. D. Œuf de pleurodèle traité par un mélange de cycloheximide (10 μg/ml) et d’eau lourde au stade 4 blastomères. Les cytasters sont flous et peu visibles, x 160.

Planche 2

Fig. C. Œuf de pleurodèle (témoin des figs. D et E), traité par l’eau lourde seule au stade 4 blastomères, présentant de nombreux cytasters au pôle animal, x 160.

Fig. D. Œuf de pleurodèle traité par un mélange de cycloheximide (10 μg/ml) et d’eau lourde au stade 4 blastomères. Les cytasters sont flous et peu visibles, x 160.

Planche 3

Fig. E. Œuf de pleurodèle prétraité pendant 1 h par de la cycloheximide seule (10/ig/ml), au stade 4 blastomères, puis traité par un mélange de cycloheximide (10 μg/ml) et d’eau lourde. Les cytasters ont disparu, x 160.

Planche 3

Fig. E. Œuf de pleurodèle prétraité pendant 1 h par de la cycloheximide seule (10/ig/ml), au stade 4 blastomères, puis traité par un mélange de cycloheximide (10 μg/ml) et d’eau lourde. Les cytasters ont disparu, x 160.

Planche 4

Fig. F. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle, témoin, injecté de thymidine-3H au stade 4 blastomères. Le noyau est très fortement marqué. (Rmq.: les grains noirs visibles dans le cytoplasme sont du pigment et non du marquage.) x 640.

Fig. G. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle injecté de thymidine-3H et traité par l’eau lourde pure au stade 4 blastomères. Le noyau est dépourvu de marquage (à part 2 à 3 grains). x640.

Planche 4

Fig. F. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle, témoin, injecté de thymidine-3H au stade 4 blastomères. Le noyau est très fortement marqué. (Rmq.: les grains noirs visibles dans le cytoplasme sont du pigment et non du marquage.) x 640.

Fig. G. Autoradiographie d’un œuf de pleurodèle injecté de thymidine-3H et traité par l’eau lourde pure au stade 4 blastomères. Le noyau est dépourvu de marquage (à part 2 à 3 grains). x640.

Cette différence entre les deux espèces ne peut pas être imputée à une mauvaise perméabilité de l’œuf de xénope à la cycloheximide: en effet, des œufs témoins, placés dans une solution aqueuse de cycloheximide, se sont bloqués après quelques divisions.

En raison de ces contradictions, il est difficile de tirer une conclusion ferme des expériences: d’une part, il semble que la formation de cytasters nécessite une synthèse de protéines chez le pleurodèle; d’autre part, les résultats obtenus, dans le cas des œufs de xénope traités par la cycloheximide et ceux obtenus sur des œufs de pleurodèle soumis à l’action de la puromycine, s’opposent à cette conclusion.

Formation de cytasters en présence de mercaptoéthanol

Depuis les travaux de Mazia (1958 a, b) et Mazia & Zimmerman (1958), on sait que le mercaptoéthanol réduit les liaisons disulfures (-S-S-) qui interviennent dans l’association structurale des protéines constitutives de l’appareil mitotique, provoquant une désorganisation profonde de sa structure. Mazia, Harris & Bibring (1960) ont aussi montré que le mercaptoéthanol inhibe la duplication des centrosomes dans les œufs d’oursins, bloquant ainsi les mitoses.

Chez les œufs de Batraciens aussi, le mercaptoéthanol provoque un arrêt rapide des mitoses avec désintégration de l’appareil mitotique (Limbosch-Rolin & Brachet, 1961).

Nous avons essayé de savoir si le mercaptoéthanol est également capable d’altérer la formation des cytasters.

Les expériences ont été faites sur des œufs de pleurodèle et de xénope; à nouveau, les résultats obtenus sur ces deux espèces ne concordent pas. Dans les deux cas, des œufs (au stade 4 blastomères) ont été prétraités (ou non) par une solution aqueuse de mercaptoéthanol M/10 avant d’être soumis à l’action d’une solution de mercaptoéthanol M/10 dans du D2O. Alors que, chez le xénope, le mercaptoéthanol n’a nullement affecté la formation des cytasters, on observe chez le pleurodèle, même quand il n’y a pas eu de prétraitement, une altération nette de la formation des cytasters. Ceux-ci sont extrêmement petits et généralement recouverts de pigment; normalement, les cytasters forment des plages claires exemptes de grains de pigment. Les noyaux sont également anormaux et la fusion des chromosomes télophasiques ne se fait pas. Ces anomalies s’observent également dans les œufs de xénope traités au mercaptoéthanol; elles sont d’ailleurs caractéristiques de l’action du mercaptoéthanol sur les œufs d’amphibiens (Limbosch-Rolin & Brachet, 1961).

PLANCHE 2

Une différence de perméabilité entre les œufs des deux espèces ne peut être invoquée comme explication puisqu’on retrouve les mêmes anomalies nucléaires dans les deux cas. En outre, les œufs de xénope, comme ceux de pleurodèle, se bloquent, après une division au maximum, dans une solution aqueuse de mercaptoéthanol M/10.

Les raisons de ces différences demeurent obscures et de nouvelles recherches seront nécessaires pour les élucider; mais il est clair que la formation de cytasters est beaucoup moins sensible chez le xénope que le pleurodèle à l’action d’inhibiteurs tels que la cycloheximide et le mercaptoéthanol.

Formation de cytasters en présence de précurseurs et d’inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques

Incorporation de thymidine-3H dans des œufs de pleurodèle traités par Peau lourde

Des œufs de pleurodèle, au stade 4 blastomères, ont été injectés de 0,1 μI de thymidine-3H, à la concentration de 0,048 mg/ml (radioactivité spécifique de 5.000 mc/mM). Immédiatement après l’injection, les œufs ont été placés durant 2 h soit dans de l’eau de la ville, soit dans de l’eau lourde pure; ils ont été fixés ensuite. L’étude autoradiographique a montré que, tandis que les noyaux des œufs témoins sont très fortement marqués par la thymidine, ceux des œufs traités par l’eau lourde ne le sont que fort peu. Très souvent, les noyaux sont même totalement dépourvus de grains, si on tient compte de la radioactivité de fond. En aucun cas, nous n’avons observé de marquage des cytasters (planche 4, ügs. F, G).

Les cytasters peuvent donc se former dans des conditions où l’eau lourde inhibe fortement la synthèse du DNA nucléaire.

Traitement d’œufs de pleurodèle par l’action combinée de l’hydroxyurée et de l’eau lourde

Des œufs de pleurodèle (stade 2 blastomères) ont été prétraités pendant des temps variant de 0 à 6 h 30’ par une solution d’hydroxyurée dans l’eau à 1 mg/ml, puis ils ont été placés durant 1 h 30’ dans de l’eau lourde contenant 1 mg/ml d’hydroxyurée. Les coupes pratiquées dans ces œufs ne montrent aucune altération dans la formation des cytasters.

Il n’est pas étonnant que l’hydroxyurée, un inhibiteur de la synthèse du DNA et, à haute concentration, de la synthèse des RNA (Eisenberg, van Praag, Rosenkranz & Shemin, 1965) n’exerce pas d’effet sur l’apparition des cytasters, puisque nous venons de voir qu’ils se forment normalement en l’absence de toute incorporation de thymidine. L’un de nous (Brachet, 1967) a, d’ailleurs, montré que l’hydroxyurée n’exerce un effet inhibiteur sur le développement des œufs de Batraciens qu’au stade de la blastula avancée, c’est-à-dire au moment où les synthèses de RNA deviennent importantes (Bachvarova & Davidson, 1966; Bachvarova, Davidson, Allfrey & Mirsky, 1966).

Irradiation aux rayons X d’œufs de pleurodèle avant un traitement par l’eau lourde

On sait que les rayons X sont capables d’inhiber la synthèse du DNA et d’altérer le DNA existant. Dans les œufs de Batraciens, les altérations subies par le DNA (nucléaire et cytoplasmique) après irradiation n’empêchent pas une segmentation normale (Alexandre, 1967). C’est au stade blastula avancée ou jeune gastrula que le développement s’arrête.

Nous avons constaté que des irradiations par les rayons X d’œufs de pleurodèle indivis par des doses de 500, 1.000, 5.000 et 10.000 roentgens, suivies par un traitement par l’eau lourde pure, n’affectent pas la formation des cytasters par l’eau lourde.

Injections d’actinomycine dans des œufs de pleurodèle traités par l’eau lourde

L’actinomycine, inhibiteur des synthèses des RNA, a été utilisée afin de préciser si la formation de cytasters nécessite la synthèse d’un type quelconque de RNA.

Des œufs de pleurodèle, au stade 4 blastomères, ont été injectés d’actinomycine concentrée (1 mg/ml) et placés dans l’eau lourde 2 h 30’ plus tard. L’examen cytologique de ces œufs montre que l’actinomycine n’empêche jamais la formation des cytasters.

Ce résultat négatif n’est pas étonnant: en effet, Brachet & Denis (1963), Brachet, Denis & de Vitry (1964) ont montré que l’actinomycine, après microinjection, n’affecte nullement le clivage des œufs d’amphibiens; elle ne provoque des anomalies mitotiques, tout comme l’hydroxyurée, qu’à partir du stade de blastula avancée, au moment où les synthèses de RNA deviennent importantes.

Il ressort clairement de nos expériences que la formation de cytasters, dans les œufs d’amphibiens traités par l’eau lourde, est possible en l’absence de toute synthèse de DNA dans le noyau. En effet, ni un traitement par l’hydroxyurée, ni une irradiation aux rayons X, même à forte dose, n’empêchent la formation de ces asters. Ce qui est plus frappant encore, c’est l’inhibition totale de l’incorporation de thymidine dans les noyaux des œufs traités par l’eau lourde. Ce résultat est à rapprocher de celui obtenu par Gross & Harding (1961), qui ont également observé un blocage de la synthèse du DNA dans les œufs d’oursins traités par l’eau lourde.

Il n’est, d’ailleurs, pas surprenant que le DNA nucléaire n’intervienne pas dans la formation des cytasters, puisqu’on sait qu’ils peuvent se produire dans des fragments anucléés d’œufs d’oursins (Harvey, 1936, 1940; Lorch, 1952; Lorch, Danielli & Hôrstadius, 1953).

PLANCHE 4

Cette non intervention du DNA nucléaire dans la formation de cytasters ne permet cependant pas d’exclure un rôle possible du DNA cytoplasmique, dont on connaît bien l’existence dans les œufs de Batraciens (Brachet & Quertier, 1963; Brachet & Ficq, 1964). Nous avons montré précédemment (Van Assel & Brachet, 1966) que le cytoplasme des œufs de xénope traités à l’eau lourde se ‘colore’ à l’actinomycine radioactive: comme les œufs normaux, ils contiennent donc du DNA cytoplasmique; mais cette technique ne permet pas de démontrer une localisation particulière du DNA au niveau des cytasters.

En ce qui concerne l’intervention possible d’une synthèse de RNA messager lors de l’apparition de cytasters, nos résultats ne nous permettent pas de tirer une conclusion nette. Toutefois, le fait que l’actinomycine n’exerce aucun effet sur la formation de cytasters (même après micro-injection dans les œufs) n’est pas favorable à l’idée que leur apparition dépend d’une néo-synthèse de m-RNA. Rappelons, d’ailleurs, que l’actinomycine n’affecte pas non plus la segmentation normale des œufs d’amphibiens (Brachet & Denis, 1963; Brachet et al. 1964) ce qui donne à penser que la production de nouvelles molécules de m-RNA est de peu d’importance durant la segmentation. On en arrive à penser que les synthèses de protéines qui se font durant cette période du développement, qu’il s’agisse d’œufs normaux ou d’œufs traités par l’eau lourde, seraient dirigées par des m-RNA stables et préexistants déjà dans l’œuf vierge (Brachet, 1965).

Notons, en outre, que Gross, Spindel & Cousineau (1964) ont observé une diminution de la synthèse de RNA dans des œufs fécondés d’oursins, après traitement par l’eau lourde.

La question de savoir si la production de cytasters exige une synthèse de protéines ne trouve pas non plus de réponse absolument satisfaisante. En effet, les œufs traités par l’eau lourde incorporent de la leucine radioactive dans le noyau, dans l’appareil mitotique normal et dans tout le cytoplasme, y compris les cytasters. Mais cette incorporation ne réflète pas nécessairement la synthèse de protéines qui participeraient directement à la formation des cytasters. Le marquage des cytasters pourrait être dû à l’accumulation de ribosomes à leur niveau; ces ribosomes seraient engagés dans la synthèse de protéines (des enzymes, par exemple) qui pourraient n’avoir rien à voir avec les protéines de structure constitutives des fibres astériennes. Rappelons que Gross & Cousineau (1963) ont également observé une incorporation importante de leucine radioactive au niveau des cytasters et de l’appareil mitotique normal dans des œufs d’oursins traités par l’eau lourde. Mais, comme on l’a vu plus haut, la question de savoir si la synthèse des protéines, chez l’oursin, est plus importante dans l’appareil mitotique que dans le restant du cytoplasme demeure controversée (Gross & Cousineau, 1963; Bibring & Cousineau, 1964; Stafford & Iverson, 1964; Mangan, et al. 1965; Rinaldi, 1967; Wilt et al. 1967).

Les résultats que nous avons obtenus en utilisant des inhibiteurs des synthèses protéiques sont contradictoires d’une espèce de Batracien à l’autre et même, pour une même espèce, d’un inhibiteur à l’autre. En effet, la cycloheximide inhibe la formation de cytasters dans les œufs de pleurodèle, mais pas dans ceux de xénope. D’autre part, la puromycine n’affecte leur apparition ni dans une espèce, ni dans l’autre. Mais il est à noter que des contradictions se rencontrent aussi dans le cas de l’œuf d’oursin: bien que la puromycine arrête rapidement sa segmentation (Hultin, 1961), elle n’empêche pas la formation de cytasters. En outre, la cycloheximide (même à des concentrations aussi élevées que 100 μg/ml) n’exerce aucun effet sur le développement des œufs d’oursins (observations inédites personnelles). La situation, dans le cas de l’œuf d’oursin, est donc exactement l’inverse de celle observée par Legros (1968) chez les Batraciens: la cycloheximide y est beaucoup plus efficace, pour bloquer les mitoses, que la puromycine. De telles différences, quand on compare diverses espèces, interdiront évidemment de tirer toute conclusion générale tant qu’une étude biochimique soigneuse du mode d’action des inhibiteurs (cycloheximide et puromycine), dans le cas des œufs en voie de segmentation n’aura pas été effectuée. Mais ce n’est probablement pas un hasard si l’œuf de pleurodèle est plus sensible tant au mercaptoéthanol qu’à la cycloheximide que celui de xénope: les deux substances agissent de façon totalement différente et on peut se demander si la différence entre les deux espèces n’est pas simplement liée au développement beaucoup plus lent du pleurodèle.

Quoiqu’il en soit, rien n’exclut pour le moment l’hypothèse d’une double origine des cytasters: association de protéines préexistantes dans l’œuf et synthèse de novo.

La formation de très nombreux cytasters requiert probablement une quantité de protéines plus importante que celle de l’appareil mitotique normal. Il se pourrait que le stock de protéines qui servent de précurseurs aux asters varie d’importance d’une espèce à l’autre. Si les œufs ne contiennent pas, chez une espèce donnée, une quantité suffisante de protéines préformées pour assurer la formation d’abondants asters, une synthèse de novo de protéines deviendrait indispensable.

Mais, en se basant exclusivement sur les données expérimentales dont nous disposons actuellement, on aboutit à la conclusion que les cytasters se formeraient surtout au dépend d’éléments préexistants dans le cytoplasme des œufs. Cette hypothèse est renforcée par un travail récent de Inoué et Sato (1967). Ils ont montré que les fibres astériennes et fusoriales se forment par association de molécules protéiques préexistantes dans la cellule. Il existe un équilibre entre ces protéines libres et polymérisées, qui peut être déplacé vers l’une ou l’autre forme, soit naturellement au cours du cycle mitotique, soit par l’action de divers facteurs. Ainsi, l’eau lourde favoriserait la polymérisation de ces protéines et la formation des fibres.

  1. Les œufs de Batraciens (pleurodèles et xénopes) forment des cytasters constitués de fibres astériennes et, semble-t-il, de centrioles après traitement par de l’eau lourde concentrée.

  2. Nous avons recherché si cette production de cytasters est liée à des synthèses d’acides nucléiques et de protéines par l’utilisation de précurseurs et d’inhibiteurs de ces synthèses.

  3. Nous avons constaté que l’eau lourde inhibe totalement la synthèse du DNA nucléaire. Un inhibiteur des synthèses de DNA, l’hydroxyurée et des irradiations aux rayons X n’empêchent pas la formation des cytasters. Le DNA nucléaire ne semble donc pas jouer de rôle dans leur apparition.

  4. L’actinomycine, qui inhibe les synthèses de RNA, n’empêche pas non plus la formation de cytasters.

  5. Les œufs traités par l’eau lourde incorporent de la leucine-14C tant dans le noyau que dans le cytoplasme, notamment au niveau des cytasters. Cependant, la puromycine, qui inhibe les synthèses protéiques, n’empêche pas la formation de cytasters dans les œufs de pleurodèle et de xénope; un autre inhibiteur de ces synthèses, la cycloheximide, empêche la formation de cytasters dans les œufs de pleurodèle, mais pas dans ceux de xénope.

  6. Le mercaptoéthanol affecte l’apparition des cytasters uniquement dans l’œuf de pleurodèle.

  7. Les raisons possibles de ces résultats contradictoires d’une espèce à l’autre et d’un inhibiteur à l’autre, sont discutées.

Travail effectué dans le cadre du contrat Euratom-U.L.B. 007-61-10 ABIB.

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