ABSTRACT
The production of phocomelia in the chick embryo by the action of nitrogen mustard. IL Histological study of developing limb buds
Nitrogen mustard at a concentration of 3x 10−4M was administered to chick embryos of
days incubation (stages 18-20 of Hamburger & Hamilton). The solution was deposited either over the whole embryo or locally on the limb rudiments.
Some limb buds were examined in situ during the period 24-48 h after the administration and were subject to examination at autopsy at the 11th day of incubation. Others, both wing and leg-buds, were taken for histological examination at times between 1 h and 120 h of the beginning of treatment.
The first detectable morphological lesions appear between 24 and 30 h of the administration of the nitrogen mustard. The growth of the bud is inhibited and haematomata of varying sizes are seen at the centre of the bud or near its base.
Histological study of limb rudiments fixed within the first hours or days of treatment gives a more detailed picture of the changes suffered by them. The dense central mesenchyme with small cell nuclei is replaced by a vacuolated tissue with large cell nuclei. Forty hours after treatment the disorganization of the limb bud is characterized by the absence of the central mesenchymal condensation and the presence of lacunae, of vacuoles and pyknotic nuclei. Chondrogenesis is inhibited or delayed. Four or five days after treatment there is a reorganization of the limb rudiment. The distal structures appear, as do nodules of precartilaginous cells and muscle rudiments. Nerves and blood vessels enter the limb which is of reduced size. In those cases where the mesoderm is greatly reduced the buds degenerate. This gives rise to ectromelia, the complete absence of limbs. The ectoderm, including the apical cap, develops normally in most cases. In cases of extreme mesodermal atrophy the ectodermal covering shows signs of degeneration.
These results suggest a specific action of nitrogen mustard on mesodermal structures. They are compared with the results of other authors and their relevance to problems of mesodermal-ectodermal interactions is discussed.
INTRODUCTION
Des recherches antérieures (Salzgeber, 1963) ont montré que l’ypérite azotée, administrée à l’embryon de Poulet, entre le 3ème et le 4ème jour de l’incubation, exerce une action intense sur les ébauches de membres. 90 % des embryons, autopsiés après le 1 lème jour de l’incubation, présentent des malformations des pattes et des ailes. La phocomélie, caractérisée par l’atrophie ou la réduction extrême de segments intermédiaires a été observée chez 75 sur 154 embryons traités par l’ypérite et autopsiés à partir du 1 lème jour. Les autres embryons sont micromèles, leurs membres sont moins courts que ceux des embryons phocomèles. Dans la plupart des cas, et quelle que soit l’intensité de la malformation, la partie distale du membre est présente. Dans le cadre de l’étude de la genèse de la phocomélie, trois problèmes se sont alors posés : Sur quel territoire de membre agit l’ypérite azotée? A quel moment apparaissent les premières lésions? Quel est le type de lésion responsable de la phocomélie? Les recherches, exposées dans ce mémoire, publiées partiellement dans une note à l’Académie des Sciences (Salzgeber, 1964), concernent l’évolution morphologique et histologique des membres après traitement de l’embryon par l’ypérite azotée. Elles montrent que les premières altérations décelées par les méthodes histologiques apparaissent environ 11 h après le traitement et que l’action de l’ypérite azotée porte essentiellement sur les territoires mésodermiques.
TECHNIQUES
Les embryons de Poulet sont traités à différents stades de l’incubation (stades 18 à 21 de Hamburger & Hamilton (1951), soit 3 à 4 jours de l’incubation) par une solution d’ypérite azotée et d’eau distillée, préparée à la concentration de 3 x 10–4 M.
Deux séries d’expériences ont été effectuées :
(1) La solution (volume: 0,01 à 0,02cm3) est déposée sur la membrane vitelline de l’embryon de Poulet, de préférence sur la région située entre l’ébauche alaire et pédieuse. De ce territoire, la solution diffuse vers la région antérieure et vers la région postérieure. L’embryon est ainsi exposé en entier à l’influence de la substance toxique. Cependant, les ébauches embryonnaires sont plus ou moins atteintes, ce qui explique la diversité des malformations de membres obtenues après un tel traitement, depuis les membres réduits à leur seule partie distale jusqu’aux membres normalement conformés mais de taille réduite.
(2) Afin d’obtenir des sujets phocomèles de manière constante, j’ai cherché à localiser la substance sur le territoire patte ou sur le territoire aile. Un petit carré de pâte à modeler (4 à 5 mm de côté), percé d’un trou d’un diamètre de 2 mm, est posé sur l’ébauche de patte ou d’aile. Dans la cavité, on dépose 10 μ1 ou 0,01 cm3 de solution. L’écran est enlevé après 4 à 5 heures. Des sujets témoins sont traités de la même manière et reçoivent le même volume d’eau distillée.
Les embryons sont examinés in situ 5, 24, 48, 72 h après le traitement. Les membres étant rapidement masqués par les annexes embryonnaires, certains embryons sont autopsiés à différents stades de leur évolution. Les membres sont dessinés à la chambre claire à la même échelle. Certains d’entre eux sont fixés au liquide de Bouin, de Zenker ou de Carnoy en vue de l’étude histologique. Les préparations sont colorées à l’hématoxyline-éosine, à l’azan selon la méthode de Heidenhain ou encore au Bleu Alcian et hémalun.
Pour la mise en évidence des acides nucléiques, j’ai utilisé la réaction nucléique de Feulgen pour les ADN et la coloration au vert de méthyl-pyronine pour les ARN. La spécificité de la réaction est contrôlée par action préalable de la ribonucléase dans le cas du vert de méthyle-pyronine (Brachet, 1942). La réaction de Feulgen est contrôlée en effectuant la réaction sur une préparation non hydrolysée qui ne développe aucune coloration avec le réactif de Schiff.
RESULTATS EXPERIMENTAUX
L’évolution des pattes et des ailes a été suivie dans l’œuf 24, 48 et parfois 72 h après le traitement, si l’observation le permettait. A ce stade de développement, l’allantoide s’étend au dessus de l’embryon et masque souvent les membres. Les observations ultérieures ne peuvent être faites in situ; les embryons, examinés à ces stades précoces, sont autopsiés à l’âge de 10-11 jours, stade auquel le type de malformation : micromélie, phocomélie et ectromélie, peut être aisément reconnu.
L’ensemble des observations ont porté sur des embryons provenant de deux séries expérimentales :
(1) La solution d’ypérite azotée est déposée sur la membrane vitelline recouvrant l’embryon. On obtient des sujets phocomèles typiques et des sujets micromèles à membres raccourcis (Table 1). Les membres, 41 ailes et 32 pattes, provenant de 41 embryons, ont été examinés in situ. Dans 9 cas, les bourgeons de pattes, recouverts par l’allantoide, n’étaient pas visibles 24 h après le traitement.
(2) La solution d’ypérite azotée est localisée sur le territoire patte ou le territoire aile (Table 2). La mortalité est moins élevée dans ce cas et le type de malformation obtenue est plus constant que dans l’expérience précédente. Grâce à cette technique, on peut aussi obtenir des effets plus prononcés sur les membres sans que la survie de l’embryon en soit affectée.
Répartition des malformations 8 jours après le dépôt de la substance sur l’embryon (1ère série expérimentale) — embryons âgés de 11 jours

Répartition des malformations 8 jours après le dépôt localisé de la substance sur l’aile ou la patte de l’embryon (2ème série expérimentale) — embryons âgés de 11 jours

Etude de l’évolution des bourgeons de pattes (résultats portant sur les 2 séries expérimentales)

(A) Evolution morphologique des membres après traitement par l’ypérite azotée
Les travaux de Saunders (1948) sur l’ébauche alaire et ceux de Hampé (1959) sur l’ébauche pédieuse ont montré que le développement des jeunes bourgeons s’effectue en direction proximo-distale. Rappelons que la première ébauche du bourgeon d’aile apparaît au stade 16 de Hamburger & Hamilton (26 à 28 somites, 51 à 56 h), alors que la première ébauche de patte est reconnaissable au stade 17 (29 à 32 somites, 56 à 64 h d’incubation). La croissance des bourgeons est rapide. Ils s’allongent d’abord et au stade 24 ( jours), l’extrémité distale du bourgeon de patte commence à s’élargir; elle évoluera ultérieurement en palette pédieuse, ébauche du futur pied. A ce stade, le réseau de fins capillaires, présent dans le bourgeon de membre depuis le début du développement, est peu à peu remplacé par des vaisseaux sanguins. Au centre des bourgeons apparaissent une artère brachiale dans le cas de l’aile, une artère sciatique ou fémorale dans le cas de la patte, et dans les deux bourgeons se dessine une veine marginale périphérique.
Au stade 27 (5 à jours), des sillons séparant les doigts I, II et III sont visibles dans la palette.
Au stade 30 ( à 7 jours), on reconnaît nettement les différents segments des ailes et des pattes. Dans ce dernier cas, la cuisse avec le fémur, la jambe avec le tibia et le péroné, le pied avec les métatarsiens et les premières phalanges des doigts. La membrane interdigitale relie encore les doigts entre eux.
Au stade 34 (8 jours), les pièces cartilagineuses sont en place, la patte et l’aile ont acquis leur forme définitive. Leur croissance se poursuivra au cours des stades ultérieurs tandis que le squelette cartilagineux s’ossifiera progressivement.
Les bourgeons de membres, soumis à un traitement d’ypérite azotée, montrent d’importantes altérations morphologiques. Mais celles-ci n’apparaissent pas immédiatement. Pendant les premières 24 h, l’accroissement des membres d’embryons soumis à l’ypérite (Fig. 2) est très voisin de celui d’embryons témoins (Fig. 1) et jusqu’à ce stade, aucune lésion n’est visible extérieurement. Vers la 30ème heure, les premières lésions apparaissent; elles sont d’abord discrètes; la frange transparente de l’épiblaste se détache nettement du mésenchyme sous-jacent; le réseau sanguin est perturbé. Quarante-huit heures après le traitement, la taille du bourgeon est réduite comparée à celle du membre témoin (Figs. 1, 2); la palette distale n’apparaît pas; l’organe a un aspect transparent qui le différencie nettement des témoins du même âge, ceux-ci ayant une structure massive et compacte.
Témoins. Bourgeons de pattes traités au stade 20 de Hamburger & Hamilton ( jours) avec de l’eau distillée. Quelques bourgeons de membres (2 à 4) sont fixés 24,48,72 et 96 h après le traitement. Notons la croissance rapide des bourgeons. Les bourgeons de membres n’ont pas été dessinés, in situ, dans l’œuf, mais seulement après prélèvement dans le liquide de Tyrode. Les dessins ne représentent donc pas l’évolution d’un même bourgeon, mais se rapportent à quelques types caractéristiques observés au cours de nos expériences.
Témoins. Bourgeons de pattes traités au stade 20 de Hamburger & Hamilton ( jours) avec de l’eau distillée. Quelques bourgeons de membres (2 à 4) sont fixés 24,48,72 et 96 h après le traitement. Notons la croissance rapide des bourgeons. Les bourgeons de membres n’ont pas été dessinés, in situ, dans l’œuf, mais seulement après prélèvement dans le liquide de Tyrode. Les dessins ne représentent donc pas l’évolution d’un même bourgeon, mais se rapportent à quelques types caractéristiques observés au cours de nos expériences.
Ypérite azotée. Bourgeons de pattes traités au stade 20 avec de l’ypérite azotée (3X10−4M, volume: 10μ1). La fixation a lieu 24, 48, 72 et 96 h après le traitement. Apparition d’hématomes (en pointillé) dans les bourgeons 48 h et 72 h après le traitement. La croissance des membres est inhibée; cette inhibition débute entre 25 h et 48 h après le traitement. Les sillons des doigts représentés schématiquement par des traits et la palette pédieuse apparaissent tardivement.
Ypérite azotée. Bourgeons de pattes traités au stade 20 avec de l’ypérite azotée (3X10−4M, volume: 10μ1). La fixation a lieu 24, 48, 72 et 96 h après le traitement. Apparition d’hématomes (en pointillé) dans les bourgeons 48 h et 72 h après le traitement. La croissance des membres est inhibée; cette inhibition débute entre 25 h et 48 h après le traitement. Les sillons des doigts représentés schématiquement par des traits et la palette pédieuse apparaissent tardivement.
Des hématomes apparaissent. Ces altérations vasculaires sont plus ou moins étendues et n’ont pas de localisations bien précises. On les observe aussi bien à la base qu’au centre de l’organe; elles sont cependant plus rares à l’extrémité distale du bourgeon. Celui-ci continue de croître mais la croissance est faible. Des hématomes et des œdèmes sont encore visibles 72 h et 96 h après le traitement. Dans certains cas, on voit apparaître, dans la zone distale, les ébauches des futurs doigts mais en général la palette pédieuse est encore peu distincte; elle se dessine plus nettement 96 h après le traitement; les doigts, reliés par une membrane interdigitale sont bien marqués mais leur nombre est souvent réduit. Le zeugopode, formant la partie moyenne du membre est considérablement raccourci par rapport au zeugopode de la patte témoin (Figs. 1, 2). L’aile, atteinte par la substance toxique, présente les mêmes types d’altérations que la patte. La croissance du membre est inhibée, des hématomes et des œdèmes plus ou moins étendus apparaissent.
La plupart des pattes ou des ailes phocomèles (23 pattes, 17 ailes) provenant d’embryons âgés de 10 à 11 jours présentaient un hématome 24 à 72 h après le traitement (Tablex 3, 4), 5 pattes et 6 ailes étaient de taille réduite et avaient un aspect opaque. Ces plages hémorragiques sont surtout visibles 48 h après le traitement, elles apparaissent plus tardivement dans la patte que dans l’aile. Notons qu’à l’autopsie, on ne retrouve ni œdème, ni kyste hémorragique. Les parties distales qui subsistent sont saines, irriguées et innervées.
Les expériences de localisation de la substance sur les membres ont, en outre, montré que dans les cas de fortes hémorragies, observées 48 h après le traitement, la croissance du membre est définitivement arrêtée. A l’autopsie, l’aile ou la patte sont absentes ou encore sont réduites à de petits moignons sans structure bien définie. Le type de malformation obtenue dépend du degré d’altérations du bourgeon de membre, ces altérations étant particulièrement intenses 48 à 72 h après le traitement.
(B) Etude histologique
(1) Membres normaux
L’étude histologique des bourgeons de membres de l’embryon de Poulet a été effectuée par Saunders (1948), O’Rahilly & Gardner (1956) et récemment par Jurand (1965). Rappelons qu’au stade 16 à 17 de Hamburger & Hamilton (environ 30 somites), les bourgeons qui apparaissent comme de petits renflements de la paroi latérale du corps sont constitués de deux parties bien distinctes: un constituant mésodermique et un constituant épidermique, celui-ci formant un revêtement à l’ensemble du bourgeon.
Au stade 18 (3 jours), l’épiblaste s’épaissit à l’extrémité de l’ébauche pour former la crête apicale. Celle-ci joue un rôle important dans la morphogenèse du membre ainsi que l’ont montré les travaux de Saunders (1948), Hampé (1957, 1959) et Zwilling (1955). Elle est, à ce stade, constituée de deux couches de cellules mais elle s’épaissit au cours du développement pour atteindre un maximum de croissance aux stades 20 à 24 ( à 4 jours). Elle présente alors, 4 ou 5 couches de cellules, la couche la plus superficielle étant formée de cellules aplaties alors que dans la couche profonde, on observe des cellules cylindriques (Planche 1, fig. A). L’ectoderme et sa crête apicale sont séparés du mésenchyme sous-jacent par une membrane basale. Dans sa partie centrale, le bourgeon est constitué d’un amas de cellules mésoblastiques, de structure dense sous la crête, du côté dorsal et du côté ventral mais de structure plus lâche au centre. Les mitoses sont nombreuses à ce stade (Planche 1, fig. C). Des foyers d’éléments pycnotiques apparaissent localement. Ils ont été décrits par Saunders, Gasseling & Saunders (1962), dans certaines régions de l’ébauche alaire en voie de croissance (stades 21 à 31). Ces zones d’altérations cellulaires contribueraient à donner au membre sa forme définitive.
Aux stades 22 et 23 ( à 4 jours), les sections histologiques montrent la présence, au centre du bourgeon, d’un amas de cellules compactes à petits noyaux; cette région est nettement délimitée par des vaisseaux sanguins. Il s’agit là de la condensation du mésenchyme à partir de laquelle se formera le futur cartilage. Des troncs nerveux apparaissent à la racine du membre.
Au stade 25 ( à 5 jours) la condensation squelettique est nettement distincte de l’ébauche musculaire (Planche 3, fig. I). Ultérieurement, au stade 26 (5 jours), une zone de précartilage à noyaux arrondis occupe la partie centrale du membre. La segmentation en fémur et en tibia péroné commence à ce stade et des vaisseaux sanguins sont visibles le long de cet axe précartilagineux. Les mitoses sont nombreuses, aussi bien dans la zone de précartilage que dans le faisceau musculaire.
Les différentes pièces cartilagineuses apparaîtront progressivement au cours des stades ultérieurs; elles sont en place dans la patte de l’embryon âgé de 8 jours. Notons que l’ossification de la diaphyse des fémurs et des tibias commence à partir des stades à 7 jours.
(2) Membres soumis à Vaction de l’ypérite azotée
Les ailes et les pattes provenant de 82 embryons ont été examinées histologiquement à différents stades de leur développement. Les membres des embryons traités au stade de 3 à jours (18, 19 et 20 de Hamburger et Hamilton) ont été prélevés entre 1 et 120 h après le traitement (Table 5).
Evolution du mésoderme
Une heure à 5 h après action de l’ypérite azotée, aucune altération n’est visible dans les bourgeons. Dix à 11 h plus tard, on constate une légère différence entre les membres traités et les membres témoins. La structure du mésenchyme est moins dense et les mitoses sont moins nombreuses dans les organes traités. On observe un léger accroissement de la taille des noyaux. A un stade ultérieur, soit 17 à 18 h après le traitement, alors qu’on ne peut déceler d’anomalies morphologiques, l’étude histologique révèle une structure désorganisée; des foyers d’éléments nécrosés apparaissent dans le mésenchyme.
Vingt-quatre heures après le traitement, on est frappé par la structure lâche du mésoderme et par la grande dimension des cellules et des noyaux dont le diamètre atteint le double ou le triple de celui des noyaux des membres témoins (Planche 1, figs. A, B). Les altérations mitotiques sont nombreuses. Ce sont essentiellement des fragmentations ou des ruptures de chromosomes (Planche 1, fig. D). Aucune mitose normale n’est visible dans ce tissu alors qu’elles sont nombreuses dans l’organe non traité par l’ypérite (Planche 1, fig. C). Une zone de condensation préchondrale se dessine. On peut y observer des noyaux aberrants et pycnotiques. Dans les cas d’altérations moins prononcées, la zone de condensation est saine; les autres territoires contiennent de gros noyaux, les éléments pycnotiques sont peu nombreux.
Quarante à 48 h après action de l’ypérite azotée sur le bourgeon de membre, la vacuolisation du tissu est plus prononcée qu’au stade précédent. Les cellules sont dissociées et séparées les unes des autres par des lacunes et des vacuoles, ce qui confère à l’ensemble du bourgeon une structure peu dense. L’épiderme se détache nettement du mésoderme et parfois ce décollement est accentué par la présence d’un œdème ou d’une zone hémorragique (Planche 2, figs. E, F; (Planche 3, fig. K). Alors que l’organe témoin présente à ce stade des zones de différenciation bien individualisées : une région de condensation préchondrale au centre, des formations musculaires de part et d’autre de cette zone (Planche 3, fig. I), l’organe traité a souvent un aspect peu différencié, dépourvu de toute organisation (Planche 3, fig. K). Dans certains cas, une zone de condensation s’ébauche; dans d’autres cas, la zone de chondrification est présente mais elle est réduite et contient de nombreux éléments pycnotiques.
Notons que de nombreuses cellules ne sont pas atteintes et le tissu, quoique altéré, est capable par les cellules restées saines, de poursuivre son développement. Des mitoses normales apparaissent au sein de ce tissu (Planche 3, fig. L).
Les réactions au vert de méthyle pyronine effectuées sur des bourgeons, 24 ou 48 h après le traitement, montrent de gros amas d’un rouge intense répartis un peu au hasard dans le bourgeon (Planche 2, fig. E). Il s’agit là, vraisemblablement, d’une altération cytoplasmique consécutive à une altération des noyaux, car on y observe aussi des débris de chromatine pycnotique colorés en vert. Dans l’ensemble, le cytoplasme des cellules du mésenchyme présente une coloration à la pyronine assez dense, et, dans la plupart des cas, 1 ou 2 amas de matériel pyronine sont situés au contact du noyau. Celui-ci contient un gros nucléole. Des pycnoses et des anomalies mitotiques sont aussi visibles mais elles sont plus nettes après réaction au Feulgen; on aperçoit des ponts chromosomiques et des fragmentations de chromosomes.
Soixante-douze heures après le traitement, on observe un remaniement des structures. Les éléments pycnotiques ont disparu, les tissus qui subsistent sont sains. Mais on observe souvent des zones hémorragiques ou des lacunes qui contiennent des débris cellulaires. Des zones de condensation cellulaire, ébauche du futur cartilage, apparaissent dans la partie distale tandis qu’un petit nodule cartilagineux se développe dans la région proximale. L’innervation du membre et son irrigation par les vaisseaux sanguins s’effectuent normalement, du moins dans les territoires sains non hémorragiques. Dans la partie moyenne du bourgeon, on peut observer des amas musculaires enveloppant une zone peu différenciée, à cellules dispersées. Il s’agit, vraisemblablement, d’une altération importante d’un territoire qui, dans les conditions normales, aurait donné du cartilage.
96 et 120 h après le traitement (Planche 4, figs. M, N), le membre, bien que de dimensions réduites, présente une structure d’aile ou de patte. Les éléments cartilagineux sont peu développés; le nombre de pièces qui subsistent, dépendent du degré d’altération du l’ébauche. On constate, en outre, que l’évolution du cartilage est retardée dans le membre traité. Celui-ci contient des nodules précartilagineux alors que chez le témoin, le cartilage de la diaphyse du fémur et du tibia est déjà au stade hypertrophié, et une zone d’ossification fait son apparition.
La plupart des altérations observées dans le mésoderme de jeune bourgeon de membre ont pour conséquence l’apparition de malformations de type phocomèle ou micromèle. Dans les cas de dégénérescence intense du mésoderme, le membre est incapable de poursuivre son développement. Trois à 4 jours après le traitement, il dégénère. Le mésenchyme de telles ébauches est réduit à quelques débris cellulaires et d’importantes hémorragies contribuent à la destruction de l’organe. Les embryons, autopsiés le llème jour de l’incubation, sont des sujets ectromèles auxquels il manque soit l’aile droite, soit la patte droite ou encore les deux membres.
L’ensemble de ces observations montrent que le territoire mésodermique est toujours atteint. Le degré d’altération varie selon la dose administrée et le stade de traitement de l’embryon.
Evolution de l’ectoderme
A l’inverse du mésoderme, l’ectoderme qui le coiffe est sain dans la plupart des cas. La crête apicale à cellules hautes et cylindriques est normalement développée (Planche 1, fig. B; Planche 2, figs. E, F). Elle se maintiendra dans tous les bourgeons traités par l’ypérite azotée et qui évoluent par la suite en membres phocomèles. Notons que l’ectoderme peut présenter, 24 h après le traitement, des cellules hypertrophiées identiques à celles qu’on voit dans le mésoderme, mais elles sont rares. Des phénomènes de dégénérescence ont cependant été observés dans les cas d’altérations intenses du mésoderme, par exemple, lorsque celui-ci est réduit à une grande lacune contenant quelques débris cellulaires. Dans ces cas, l’ectoderme et la cape apicale sont présents mais ils s’effritent. De tels membres dégénèrent, et à l’autopsie, on ne retrouve qu’un minuscule moignon.
CONCLUSIONS
Ces recherches montrent que la croissance et la différenciation du bourgeon de membre, traité par l’ypérite azotée, sont gravement perturbées. Aux doses utilisées, cette altération n’est pas immédiate; le bourgeon continue de croître. Les premiers signes morphologiques de dégénérescence des bourgeons de membre n’apparaissent qu’environ 30 h après le traitement, mais les observations histologiques révèlent des anomalies aux stades plus précoces, environ 11 h après le traitement.
L’action de l’ypérite azotée porte essentiellement sur les structures mésodermiques; ce sont d’abord des perturbations discrètes: diminution du nombre des mitoses, hypertrophie des noyaux et des cellules, suivie 24 à 72 h après le traitement de figures de dégénérescences importantes. Des mitoses anormales, des altérations chromosomiques, des foyers de pycnoses et de cellules nécrotiques apparaissent. Le tissu prend un aspect lacunaire et vacuolaire alors qu’il est dense et compact chez le témoin. L’apparition d’hématomes contribuent à la dégénérescence du tissu. Cependant, des régions à cellules saines subsistent et présentent une activité mitotique intense. Notons que la substance n’agit pas de manière élective sur un territoire précis du mésoderme. Du 3ème au 5ème jour après le traitement, les tissus se différencient; de petits nodules cartilagineux et des amas musculaires apparaissent : des nerfs et des vaisseaux sanguins pénètrent dans les membres. Ces recherches montrent que l’ypérite azotée provoque 2 types de lésions :
(1) Altérations des noyaux du constituant mésodermique à un stade où celui-ci présente une activité mitotique intense. Les mitoses sont arrêtées, entraînant l’inhibition de la croissance du bourgeon.
(2) Apparition d’hématomes plus ou moins étendus, environ 40 h après le traitement, attestant une action de l’ypérite sur la paroi des vaisseaux.
Quelle est la lésion responsable de la genèse des malformations de membre de type phocomèle, brachymèle ou ectromèle? Ancel & Lallemand (1942) et Jost (1950) ont montré que des hémorragies intraembryonnaires pouvaient entraîner des dégénérescences de membres. Les hémorragies, selon Ancel & Lallemand (1942), apparaissent de 16 à 36 h après le dépôt de certaines substances sur l’embryon, elles disparaissent 24 à 48 h après leur apparition. Des cas d’ectromélie ou d’hémiméiie de membres postérieurs ont été signalés par Ancel (1950) après action de diverses substances telles que le bleu Trypan, la quinine et la strychnine. Jost (1950), administrant certaines préparations hypophysaires au foetus de rat ou de lapin observe des lésions des extrémités avec dégénérescence complète de la partie distale. Il observe la formation d’œdèmes et une dilatation des vaisseaux produisant une extravasation sanguine.
Etant donné le pourcentage élevé de malformations obtenues après action de l’ypérite azotée, on peut penser que les deux types de lésions interviennent dans la dégénérescence du mésoderme.
Le revêtement ectodermique et sa crête apicale évoluent normalement dans la plupart des cas. Une telle action préférentielle sur les tissus mésodermiques a été signalée par d’autres auteurs. Chez les batraciens, Gillette & Bodenstein (1946) constatent que l’ypérite azotée agit sur le mésenchyme cartilagineux du membre. Après traitement, le bourgeon continue sa croissance pendant plusieurs jours puis il dégénère. Des sections, faites à ce stade, montrent la présence de nombreux noyaux hypertrophiés. Les auteurs pensent que les zones de prolifération intense sont électivement atteintes par la substance toxique. Jurand (1961,1963) insiste également sur l’activité antimésodermique de dérivés de l’ypérite azotée. Chez l’embryon de Souris, où de telles substances provoquent des raccourcissements de membres, le mésoblaste présente des phénomènes de nécrose localisés à la partie interne du mésoderme, mais l’épiderme et les 2 ou 3 couches de cellules mésodermiques adjacentes à l’épiderme sont préservées. Récemment, Rickenbacher (1963), étudiant l’action de la thalidomide sur les ébauches de membres de l’embryon de Poulet âgé de 2 jours, observe des phénomènes de nécrose dans le mésenchyme des bourgeons de membre traités. Ces foyers d’altérations sont localisés à la zone proximale et à la zone centrale. Les noyaux se sont contractés et le cytoplasme très éosinophile est décomposé. En laissant incuber des embryons de Poulet pendant un certain temps dans une atmosphère pauvre en oxygène, Naujoks (1953) et RÜbsaamen (1955) obtiennent des malformations de pattes et en particulier des micromèles. L’étude histologique révèle l’absence ou la réduction de la cape apicale chez les sujets malformés.
Au cours de mes expériences, j’ai obtenu 3 types de malformations: la micromélie, la phocomélie et l’ectromélie. Les études histologiques montrent que l’obtention de ces divers types d’anomalies dépend essentiellement du degré d’altération du mésoderme. Dans les cas de la micromélie et de la phocomélie, l’ectoderme et la cape apicale se développent normalement, même en présence d’un mésoderme altéré. Dans le cas de l’ectromélie, l’atteinte du mésoderme est plus sévère, l’ectoderme et sa cape apicale présentent également des signes de déficience. La substance toxique agit-elle dans ces cas extrêmes sur les 2 constituants ou bien l’ectoderme ne peut-il se maintenir en présence d’un mésoderme profondément altéré?
On sait qu’il existe des interactions étroites entre les constituants ectodermiques et mésodermiques de l’ébauche de membre. La calotte ectodermique est indispensable au mésoderme pour assurer sa croissance et former des parties distales (Saunders, 1948; Zwilling, 1955, 1956; Hampé, 1959); inversement, le mésoderme maintient l’activité de l’ectoderme apical (Saunders, 1949; Saunders & Gasseling, 1963; Zwilling, 1949, 1964; Zwilling & Hansborough, 1956). Il est certain que l’atteinte de l’un des territoires perturbe le développement normal de l’ébauche. Dans le cas de la phocomélie, l’action de la substance tératogène porte sur l’ensemble du territoire mésodermique; mais des régions saines subsistent. On peut imaginer que l’épiblaste continue d’exercer son pouvoir inducteur sur ce tissu mais celui-ci, plus ou moins altéré perd sa compétence et ne peut fournir suffisamment de matériel pour édifier un zeugopode complet. Des territoires sains, situés sous la cape apicale, pourraient être induits à former des doigts.
Dans le cas de l’ectromélie, le mésoderme perturbé aurait perdu toute sa compétence et ne pourrait plus maintenir la cape apicale. Ce phénomène provoquerait non seulement un arrêt de croissance du mésoderme mais encore l’absence de parties distales entraînant ainsi la dégénérescence complète du membre. Ajoutons que l’administration d’ypérite azotée aux stades précoces, avant l’apparition morphologique du bourgeon de membre, a pour conséquence la production de sujets ectromèles. Or d’après les recherches de Kieny (1960), le mésoderme à ces stades précoces induit l’ectoderme à s’épaissir en une crête apicale. On peut penser qu’après action de l’ypérité azotée, le mésoderme ne peut plus induire cette crête nécessaire à l’évolution ultérieure du membre.
Des recherches sont actuellement en cours, qui, nous l’espérons, apporteront les preuves expérimentales de cette action élective de l’ypérite azotée sur les territoires mésodermiques du membre.
RÉSUMÉ
Les embryons de Poulet, âgés de 3 à
jours (stades 18 à 20) sont traités à l’ypérite azotée, avec une dose de 3 x 10−4 M. La substance est déposée, soit sur l’ensemble de l’embryon, soit localement sur les ébauches de membres.
Les bourgeons sont examinés, in situ, pendant 24 à 48 h, puis ils sont autopsiés le llème jour de l’incubation. D’autres bourgeons, ailes et pattes, sont prélevés à différents stades du développement, environ 1 h à 120 h après le traitement, et sont soumis à l’examen histologique.
Les premières lésions, décelables morphologiquement, apparaissent entre 24 et 30 h après le traitement. La croissance du bourgeon est inhibée; des hématomes, plus ou moins étendus, sont visibles au centre ou à la base du bourgeon.
L’étude histologique des ébauches de membres, effectuée quelques heures ou plusieurs jours après le traitement, apporte des précisions sur le mode d’altérations du membre. La structure compacte du mésenchyme central à petits noyaux fait place à un tissu de structure vacuolaire à gros noyaux. Quarante heures après le traitement, on observe une désorganisation importante de la structure du bourgeon de membre, caractérisée par l’absence de condensation du mésenchyme dans la zone centrale, la présence de lacunes, de vacuoles et de noyaux pycnotiques. Le développement du cartilage est inhibé ou retardé. Quatre à cinq jours après le traitement, on observe une réorganisation des structures. Les parties distales se forment, des nodules de pré-cartilage ainsi que des ébauches musculaires apparaissent. Des nerfs et des vaisseaux sanguins pénètrent dans le membre. Celui-ci est de taille réduite. Dans les cas d’atteinte sévère du mésoderme, les bourgeons dégénèrent. On obtient alors des sujets ectromèles, dépourvus de membres. L’autre constituant, l’ectoderme et sa cape apicale, évoluent normalement dans la plupart des cas. En présence d’un mésoderme très altéré et réduit, le revêtement ectodermique présente des signes de dégénérescence.
Ces résultats font penser à une action spécifique de l’ypérite azotée sur les structures mésodermiques. Les résultats sont comparés à ceux qui ont été obtenus par d’autres auteurs et sont discutés dans le cadre des problèmes des interactions entre mésoderme et ectoderme.
TRAVAUX CITES
Sections de bourgeons de pattes provenant d’embryons âgés de 4 jours (stades 19 de H. & H.+ 24 h.). Traitement au stade de 3 jours (stade 19) et fixation 24 h après le traitement. Fig. A. Bourgeon témoin traité à l’eau distillée. Le mésenchyme (M), de structure dense, est recouvert d’un épiderme. L’ectoderme (E) s’épaissit dans la zone marginale pour former une crête apicale (cd).
Fig. B. Bourgeon traité à l’ypérite azotée. Le mésenchyme (M) présente une structure vacuolaire à gros noyaux. La crête apicale (cd) est bien développée.
Fig. C. Fragment du bourgeon de patte témoin. Zone moyenne. Nombreuses mitoses dans le mésenchyme de structure dense.
Fig. D. Fragment du bourgeon de patte traité à l’ypérite azotée. Zone moyenne — au même grossissement que la patte témoin. Présence de noyaux hypertrophiés, d’éléments pycnotiques (py) et de mitoses aberrantes.
Sections de bourgeons de pattes provenant d’embryons âgés de 4 jours (stades 19 de H. & H.+ 24 h.). Traitement au stade de 3 jours (stade 19) et fixation 24 h après le traitement. Fig. A. Bourgeon témoin traité à l’eau distillée. Le mésenchyme (M), de structure dense, est recouvert d’un épiderme. L’ectoderme (E) s’épaissit dans la zone marginale pour former une crête apicale (cd).
Fig. B. Bourgeon traité à l’ypérite azotée. Le mésenchyme (M) présente une structure vacuolaire à gros noyaux. La crête apicale (cd) est bien développée.
Fig. C. Fragment du bourgeon de patte témoin. Zone moyenne. Nombreuses mitoses dans le mésenchyme de structure dense.
Fig. D. Fragment du bourgeon de patte traité à l’ypérite azotée. Zone moyenne — au même grossissement que la patte témoin. Présence de noyaux hypertrophiés, d’éléments pycnotiques (py) et de mitoses aberrantes.
Fig. E. Bourgeon de patte fixé 24 h après traitement par l’ypérite azotée. Coloration au vert de méthyle-pyronine. Noter la forte dégénérescence du mésoderme (M), alors que la cape apicale (cd) est saine. Nombreux noyaux pycnotiques. Présence de petits agglomérats intensément colorés en rouge (pyronine ->).
Fig. F. Bourgeon de patte traité à l’ypérite au stade de 3 jours (stade 19), 48 h après le traitement. Structure lacunaire. Présence d’un œdème à gauche. Noyaux à gros nucléole. La cape apicale (cd) est bien développée. (Vert de méthyle pyronine.)
Fig. G. Fragment d’un bourgeon de membre d’un embryon âgé de jours. Prélèvement du bourgeon de patte 22 h après le traitement. Structure lacunaire. Présence de nombreux noyaux aberrants.
Fig. H. Détail de la fig. G montrant un groupe de mitoses anormales.
Fig. E. Bourgeon de patte fixé 24 h après traitement par l’ypérite azotée. Coloration au vert de méthyle-pyronine. Noter la forte dégénérescence du mésoderme (M), alors que la cape apicale (cd) est saine. Nombreux noyaux pycnotiques. Présence de petits agglomérats intensément colorés en rouge (pyronine ->).
Fig. F. Bourgeon de patte traité à l’ypérite au stade de 3 jours (stade 19), 48 h après le traitement. Structure lacunaire. Présence d’un œdème à gauche. Noyaux à gros nucléole. La cape apicale (cd) est bien développée. (Vert de méthyle pyronine.)
Fig. G. Fragment d’un bourgeon de membre d’un embryon âgé de jours. Prélèvement du bourgeon de patte 22 h après le traitement. Structure lacunaire. Présence de nombreux noyaux aberrants.
Fig. H. Détail de la fig. G montrant un groupe de mitoses anormales.
Sections sagittales de bourgeons d’ailes. Traitement au stade de 3 jours (stade 19 de H. & H.). Fixation : 48 heures après le traitement.
Fig. I. Bourgeon témoin. Noter la structure très dense du mésenchyme. On peut observer un début de différenciation avec une condensation préchondrale (C) au centre et des amas myogènes de part et d’autre.
Fig. J. Détail de la figure 9 — région de la crête apicale (cd).
Fig. K. Bourgeon traité à l’ypérite azotée. Altérations du tissu mésodermique. Nombreuses lacunes. L’ectoderme et sa crête sont conservés.
Fig. L. Fragment du bourgeon représenté fig. K. Région de la crête apicale (cd). Des lacunes et des vacuoles dissocient les cellules. Mais présence d’éléments sains et de divisions mitotiques normales (→).
Sections sagittales de bourgeons d’ailes. Traitement au stade de 3 jours (stade 19 de H. & H.). Fixation : 48 heures après le traitement.
Fig. I. Bourgeon témoin. Noter la structure très dense du mésenchyme. On peut observer un début de différenciation avec une condensation préchondrale (C) au centre et des amas myogènes de part et d’autre.
Fig. J. Détail de la figure 9 — région de la crête apicale (cd).
Fig. K. Bourgeon traité à l’ypérite azotée. Altérations du tissu mésodermique. Nombreuses lacunes. L’ectoderme et sa crête sont conservés.
Fig. L. Fragment du bourgeon représenté fig. K. Région de la crête apicale (cd). Des lacunes et des vacuoles dissocient les cellules. Mais présence d’éléments sains et de divisions mitotiques normales (→).
Fig. M. Patte normale d’un embryon de jours. Traitement à l’eau distillée au stade 20 ( jours) et fixation 96 h après le traitement. Les pièces cartilagineuses sont nettement différenciées. F, fémur; T, tibia; MT, métatarsien.
Fig. N. Patte d’un embryon de jours. Traitement à l’ypérite azotée (stade 20) et fixation 96 h après le traitement. Réduction du membre. Les pièces cartilagineuses sont peu développées. ne, Nodules cartilagineux; n, nerf; Mu, muscle.)
Fig. M. Patte normale d’un embryon de jours. Traitement à l’eau distillée au stade 20 ( jours) et fixation 96 h après le traitement. Les pièces cartilagineuses sont nettement différenciées. F, fémur; T, tibia; MT, métatarsien.
Fig. N. Patte d’un embryon de jours. Traitement à l’ypérite azotée (stade 20) et fixation 96 h après le traitement. Réduction du membre. Les pièces cartilagineuses sont peu développées. ne, Nodules cartilagineux; n, nerf; Mu, muscle.)