Self-differentiation and induction of cartilage from chick somitic mesenchyme cultured in vitro

  1. It has been shown (Strudel & Watterson) that in the absence of inductors (neural tube and notochord) the somitic mesenchyme of the chick embryo does not differentiate in situ into cartilage until after the 27-30 somite stage. In culture, in a medium based upon embryo extract (diluted or undiluted), cartilage only differentiates in mesenchyme taken from embryos of 27 somites. If, on the other hand, the mesenchyme is wrapped in vitelline membrane and cultured in a medium containing undiluted embryo extract it self-differentiates from the 17-somite stage.

  2. Differentiation into cartilage can be obtained in mesenchyme taken from younger embryos if extracts of inductors—neural tube and notochord—are added to the culture medium. In these circumstances chondrogenesis may occur in mesenchyme from an embryo of 20 somites when the embryo extract is diluted or from an embryo of 13 somites if it is not. If the somitic mesenchyme from 8 somite embryos is both wrapped in vitelline membrane and cultured in a medium based upon undiluted embryo extract then differentiation of cartilage occurs.

  3. These results show that the time-relations of chondrogenesis from chick somitic mesenchyme cultured in vitro varies with the composition of the medium and with the method of culture. These variations make it clear that the capacity of somitic mesenchyme to differentiate into cartilage may exist at very early stages. This early capacity is not revealed unless the somitic mesenchyme is cultured in a very favourable nutritive medium and in the presence of extracts of inducing tissues.

Strudel (1953, 1955) et Watterson (1954), ont montré qu’ in ovo, en l’absence des organes inducteurs—tube nerveux et chorde—le mésenchyme somitique est incapable de se différencier en cartilage avant le stade de 27 à 30 somites. En greffes chorioallantoïdiennes ou coelomiques Hoadley (1925), Murray et Selby (1933), et Seno et Büyükôzer (1958) ont obtenu du cartilage à partir de somites prélevés sur des embryons donneurs au stade de 20 ou de moins de 20 paires de somites. Watterson et al. (1954) et Avery étal. (1956), n’ont obtenu du cartilage qu’à partir de greffons prélevés sur des embryons de 3 jours. En culture in vitro, Avery et al. (1956) et Lash et al. (1957) ont observé la différenciation en cartilage de somites prélevés au stade de 18 à 20 de Hamburger et Hamilton. Ces résultats discordants indiquent l’influence exercée par le milieu—de l’hôte ou du milieu de culture—sur la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique isolé. Par le présent travail, nous désirons apporter une contribution à l’étude de l’influence du milieu et de la méthode de culture sur la chondrogenèse vertébrale à partir de mésenchyme somitique cultivé in vitro.

Nos résultats fournissent une contribution à l’étude de deux problèmes. En premier lieu, ils fournissent une contribution à l’étude du phénomène de l’autodifférenciation en cartilage du mésenchyme somitique cultivé in vitro. Nous utilisons le mot autodifférenciation dans un sens large. Nous ne voulons pas prétendre que le mésenchyme somitique n’ait subi aucune influence inductrice du tube nerveux et de la chorde, avant d’avoir été explanté in vitro. Nous affirmons simplement que pendant la durée de la culture il ne subit plus cette action de sorte qu’on peut qualifier de différenciation ‘autonome’ toute différenciation qui intervient au cours de la culture.

En deuxième lieu, nos résultats contribuent à élucider le rôle du facteur actif contenu dans l’extrait des organes inducteurs. Ce facteur, additionné au milieu de culture, provoque la différenciation en cartilage du mésenchyme somitique cultivé in vitro, car du mésenchyme prélevé dans des conditions identiques, mais cultivé sur le milieu dépourvu d’extrait, reste indifférent.

(Pour tous les détails voir Strudel, 1962a) 

Nous utilisons la méthode de culture mise au point par Wolff et Haffen (1952). Des cultures ont été faites sur le Milieu standard de Wolff et Haffen. Il comprend : 6 volumes d’une solution de gélose à 1 % préparée dans le liquide de Gey; 3 volumes de jus d’embryons de Poulet de 9 jours dilué à 50% dans le liquide de Tyrode et 3 volumes de solution de Tyrode additionnée de pénicilline. Au milieu expérimental nous ajoutons 3 volumes d’extrait de tube nerveux et de chorde et nous augmentons d’autant le volume de la solution de gélose. Il nous a paru nécessaire d’adapter la composition du milieu nutritif aux besoins nutritifs du mésenchyme somitique. Pour cela nous avons remplacé dans un milieu, que nous appelons ‘milieu enrichi’, le jus d’embryon dilué à 50 % par du jus pur d’embryon de 9 jours. Par ailleurs, nous avons dans certains cas, additionné aussi bien au milieu standard qu’au milieu enrichi, 1 à 3 volumes de sérum de Poulain. Nous utilisons également la modification apportée récemment par Wolff (1960, 1962) à la méthode de culture du Labora-toire, consistant à envelopper l’explant dans un fragment de membrane vitelline de l’oeuf de Poule non incubé.

Les explants de mésenchyme somitique sont constitués par une double rangée de 3 à 15 somites prélevés à différents niveaux sur des embryons de 8 à 28 paires de somites. Le mésenchyme est prélevé avec l’ectoderme et l’endoderme adjacents. Par contre, nous évitons soigneusement de prélever des somites céphaliques et du matériel des plaques latérales. Les explants sont placés directement sur la surface du milieu de culture ou posés sur un fragment de membrane vitelline étalé préalablement sur le milieu. La membrane est repliée ensuite sur l’explant, qui est alors enveloppé comme dans un sac.

L’extrait de tube nerveux et de chorde utilisé (Strudel, 1959, 1962a) est le surnageant obtenu par centrifugation d’un microbroyat de 80 à 100 tubes nerveux et chordes prélevés sur des embryons de 3 jours à 3 jours . L’extrait est, soit incorporé directement au milieu de culture, soit introduit dans le sac formé par la membrane vitelline entourant certains expiants.

Quelle que soit la composition du milieu utilisé, ou la méthode de culture employée, les explants perdent très rapidement leur organisation. Le mésen-chyme va former une masse homogène où toute segmentation somitique a disparu. La forme de l’explant varie avec la méthode de culture employée. Le tissu cartilagineux, formé aussi bien par l’action de l’extrait des organes induc-teurs que par autodifférenciation, se présente sous forme d’un nodule ou d’une baguette, en général unique, placé dans n’importe quel sens de l’explant. On ne constate aucune organisation du tissu cartilagineux rappelant la colonne vertébrale, pas même une série de nodules évoquant une suite de vertèbres.

Dans un premier chapitre, nous rappellerons brièvement des résultats (Strudel, 1959, 1962) obtenus par la culture de mésenchyme somitique sans membrane vitelline avant d’exposer dans le deuxième chapitre les résultats de la culture de somites entourés d’un fragment de membrane vitelline.

Culture de mésenchyme somitique sans membrane vitelline

Ces cultures ont été faites sur deux types de milieu de culture: (a) sur le milieu standard du Laboratoire (voir—Technique) à base de jus d’embryon de 9 jours dilué à 50 %; (b) sur le milieu enrichi à base de jus d’embryon pur.

Sur le milieu standard la chondrogenèse par autodifférenciation débute seulement dans des explants prélevés sur des embryons au stade de 27 paires de somites. Sur le milieu expérimental, additionné de l’extrait des organes inducteurs, la chondrogenèse commence déjà dans des explants prélevés sur des embryons se trouvant au stade de 20 somites.

Sur le milieu enrichi le stade de la chondrogenèse obtenue par autodifférenciation ne varie pas. Il débute encore dans du mésenchyme prélevé sur des embryons au stade de 27 somites. Par contre, les explants cultivés sur le milieu additionné de l’extrait des organes inducteurs, se différencient en cartilage à partir de mésenchyme prélevé sur des embryons du stade de 13 paires de somites.

Rappelons que l’addition de sérum de Poulain à l’un ou à l’autre de ces deux milieux, améliore légèrement la culture mais ne modifie pas la chronologie de la chondrogenèse.

Experiences de culture, sur le milieu enrichi, de mésenchyme somitique entouré d’un fragment de membrane vitelline

Dans un travail récent, Wolff (1962) décrit une nouvelle technique de culture organotypique consistant à envelopper l’explant dans un fragment de membrane vitelline de l’oeuf de Poule non incubé. La membrane vitelline est soigneusement lavée dans du Tyrode pour la débarrasser de l’albumine et du vitellus. Des fragments carrés ou rectangulaires de 0,2 à 0,4 cm. de côté, sont étalés sur le milieu de culture. L’explant de mésenchyme est disposé sur la membrane vitelline qui est ensuite repliée et enferme ainsi l’expiant comme dans un sac. Les explants sont fixés après 8 à 12 jours de culture et sont exploités histologiquement par les mêmes procédés que les explants ordinaires.

Du point de vue histologique, la grande différence entre les explants ordinaires et les explants cultivés dans la membrane vitelline, est que ces derniers sont dépourvus de membrane limitante (Planche 1, figs. 3, 4); Planche 2, figs. 5, 6,7,8). C’est la membrane vitelline (Planche 1, figs. 3,4, Vi.) qui sert d’enveloppe protectrice à l’expiant. L’absence de membrane enveloppante mise à part, on retrouve les mêmes éléments histologiques que dans les explants ordinaires : du mésenchyme indifférencié (Planche 1, fig. 3, 4; Planche 2, figs. 5, 6, 7, 8, M); des paquets de cellules musculaires (Planches 2, fig. 5, m.); des éléments de l’appareil urinaire (Planche 2, fig. 6, Tu.) ; des lacunes (Planche 2, fig. 7, L) ; et des nodules de tissu kératinisé (Planche 1, fig. 3, Planche 2, figs. 6, 7, 8, K). Les nodules kératinisés sont plus volumineux et beaucoup plus abondants que dans les explants cultivés sans membrane vitelline. Dans l’ensemble, les explants cultivés dans la membrane vitelline sont plus sains que les explants ordinaires. (Planche 1, figs. 1, 2). Le mésenchyme conserve une structure plus typique, ses cellules se multiplient activement. Après 12 jours de culture on peut encore trouver des cellules mésenchymateuses en voie de division. L’utilisation de la membrane vitelline permet de cultiver de très petites quantités de mésenchyme somitique. Des expiants, formés de deux ou de trois paires de somites seulement, évoluent favorablement et donnent, après 11 jours de culture, une masse assez importante de tissu (Planche 1, figs. 1,2), ce qui implique une activité mitotique intense au cours de la culture. Par ailleurs, du mésenchyme somitique prélevé sur des embryons de 8 paires de somites (stade 9 à 10 de H. et H.) et sur des embryons plus jeunes encore (Planche 1, figs. 1, 2), ainsi que du mésenchyme insegmenté se cultivent avec succès. Les pourcentages d’explants nécrosés (voir Tableau 1) sont les plus faibles que nous ayons enregistrés: 17,5 % pour les explants témoins et 10,3 % pour les explants expérimentaux.

Tableau 1.

Résultats numériques des expériences de culture, sur le milieu enrichi, de mésenchyme somitique entouré de la membrane vitelline

Résultats numériques des expériences de culture, sur le milieu enrichi, de mésenchyme somitique entouré de la membrane vitelline
Résultats numériques des expériences de culture, sur le milieu enrichi, de mésenchyme somitique entouré de la membrane vitelline

La conjonction réalisée par l’utilisation simultanée du jus d’embryon pur et de la membrane vitelline crée donc des conditions de culture du mésenchyme somitique particulièrement favorables. Elles ont eu des répercussions importantes sur la chronologie de la chondrogenèse vertébrale.

Expiants témoins

Sur les 89 explants survivants, 25 présentent des formations cartilagineuses (voir Tableau 2). Les explants ayant subi cette autodifférenciation de cartilage ont tous été prélevés sur des embryons se trouvant au stade de 17 paires de somites ou à des stades plus avancés. Nous ignorons pourquoi 6 expiants, prélevés dans les mêmes conditions, sont restés à l’état de mésenchyme. Tous les explants prélevés sur des embryons, dont le stade de développement était plus jeune que 17 paires de somites, sont restés indifférenciés. Ces résultats montrent que le stade minimal des embryons ayant fourni du mésenchyme somitique capable de s’autodifférencier en cartilage est de 17 paires de somites.

Tableau 2.

Age des embryons de Poulet donneurs, niveau auquel ont été prélevés les explants et résultats des cultures in vitro

Age des embryons de Poulet donneurs, niveau auquel ont été prélevés les explants et résultats des cultures in vitro
Age des embryons de Poulet donneurs, niveau auquel ont été prélevés les explants et résultats des cultures in vitro

Nous rappelons que sur le milieu standard et le milieu enrichi le stade minimal des embryons, dont le mésenchyme somitique faisait de la chondrogenèse par autodifférenciation, était de 27 paires de somites. Ce stade se rapproche sensiblement de celui des embryons ayant subi, in ovo, une excision des organes inducteurs. Chez ces embryons, le cartilage vertébral n’apparaît pas avant le stade de 27 à 30 paires de somites (Strudel, 1953a et h; Watterson, 1954). La nouvelle méthode de culture crée donc un ensemble de conditions physiques et chimiques—anormales bien sûr—mais qui sont très favorables à la différenciation du cartilage. La chondrogenèse se fait plus précocement. Les conditions de culture sont telles, qu’elles permettent ou provoquent l’autodifférenciation du cartilage avec une avance dans le temps ou dans l’évolution de l’embryon correspondant à la période nécessaire à la formation de 10 paires de somites.

Expiants expérimentaux

Soixante dix neuf des 95 explants expérimentaux ont été prélevés sur des embryons se trouvant à un stade plus jeune que 17 paires de somites (voir Tableau 2). Les 16 explants restants ont été prélevés sur des embryons dont le stade était égal ou plus âgé que 17 paires de somites. Chez ces derniers explants la différenciation cartilagineuse a pu intervenir aussi bien sous l’action de l’extrait actif que par autodifférenciation. Nous ne tiendrons donc pas compte de ces 16 résultats dans nos discussions.

Parmi les 79 explants expérimentaux prélevés sur des embryons dont le stade est compris entre 8 et 16 paires de somites, quatorze’ explants sont restés indifférenciés. Soixante cinq explants présentent des formations cartilagineuses plus ou moins étendues (Figs. 4, 6). Les explants témoins prélevés dans les mêmes conditions mais cultivés sans l’addition d’extrait inducteur, sont restés indifférenciés (voir Tableau 2). Ce résultat met en lumière les propriétés inductrices de cartilage de l’extrait des organes inducteurs. Le cartilage des explants expérimentaux se présente sous forme d’un nodule ou d’une baguette-L’aspect du cartilage varie d’un expiant à l’autre. (Planche 1, fig. 4; Planche 2, fig. 6) ou à l’intérieur du même expiant (Planche 2, fig. 8, C). Parfois, il se trouve à l’état de cartilage bien différencié avec des cellules arrondies, bien encapsulées, ou bien la substance interstitielle est peu abondante et les cellules ont encore une forme allongée ou étoilée (Planche 1, fig. 4; Planche 2, figs. 6, 8, C). Cette diversité des formations cartilagineuses dépend pour beaucoup de la durée de culture des explants et également de leur état général. Le résultat le plus intéressant de la culture, sur le milieu enrichi, des explants expérimentaux entourés d’un fragment de membrane vitelline, est le décalage du stade de la chondrogenèse.

C’est ce qui est mis en évidence par le résumé suivant

Chondrogenèse des explants témoins

Chondrogenèse des explants expérimentaux (cultivés en présence de l’extrait des organes inducteurs).

L’utilisation combinée du milieu enrichi et de la membrane vitelline crée donc, pour les explants témoins et les explants expérimentaux, des conditions de culture particulièrement favorables. Elles permettent au facteur actif contenu dans l’extrait des organes inducteurs de provoquer la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique très jeune (embryon de 8 paires de somites) et existant en très petite quantité (2 à 3 paires de somites).

Quelles peuvent être les causes provoquant à la fois cette évolution favorable des explants et ce décalage de la chondrogenèse ? Nous supposons, d’une part qu’elles sont d’ordre chimique et, d’autre part, de nature physique. Il semble que la souplesse, la minceur et la perméabilité de la membrane vitelline en font une membrane propice à la culture de mésenchyme somitique. Elle évite à l’explant l’élaboration d’une membrane qui lui est propre. Elle empêche la dispersion des cellules mésenchymateuses et permet ainsi la culture de mésen-chyme très jeune ou en petite quantité en maintenant la cohésion des cellules de l’expiant. La nutrition de l’explant doit également se faire dans de meilleures conditions. La membrane limitante créée par l’expiant cultivé sans membrane vitelline, se kératinise le plus souvent et empêche ainsi une bonne pénétration des aliments ce qui entraîne une rapide nécrose. Par contre, la membrane vitelline ne semble rien perdre de sa perméabilité au cours de la culture, ce qui explique, peut-être, la diminution du taux de nécrose signalée plus haut.

Les résultats des cultures de mésenchyme somitique obtenus grâce à l’utilisation de la membrane vitelline, fournissent peut-être une explication des faits constatés par Seno et Büyükôzer (1958). Ces auteurs prélèvent sur des embryons de Poulet de 9 à 20 somites du mésenchyme somitique seul ou garni de l’ecto-derme et de l’endoderme adjacents ou de l’une ou l’autre seulement de ces deux membranes. Ils greffent ces tissus dans le coelome ou sur la membrane chorio-allantoïdienne. Seuls les greffons pourvus de l’ectoderme et de l’endoderme ou de l’une ou l’autre des deux membranes fournissent du cartilage. Le mésen-chyme greffé seul se disperse. Les auteurs pensent que l’ectoderme et l’endo-derme jouent un rôle inducteur dans la différenciation du cartilage. Nous supposons que l’ectoderme et l’endoderme jouent un rôle comparable à celui de la membrane vitelline : ils empêchent la dispersion des cellules du mésenchyme et permettent ainsi sa différenciation en cartilage.

Faut-il, pour expliquer l’amélioration des résultats de culture du mésenchyme somitique, tenir compte de l’action qu’ auraient pu exercer l’albumine ou d’éventuelles traces de vitellus restées sur la membrane vitelline ? Pour répondre à cette question, nous avons entrepris des cultures de mésenchyme somitique sur le milieu enrichi auquel nous avons incorporé soit de l’albumine, soit du vitellus d’oeuf de poule non incubé. Sur 50 explants cultivés sur le milieu contenant de l’albumine, 24 se sont nécrosés. Du cartilage n’est apparu par autodifférenciation dans les explants restants que dans ceux qui ont été prélevés sur des embryons au stade de 25 à 26 somites. Des 50 explants cultivés sur le milieu enrichi auquel était incorporé du vitellus, 15 explants seulement se sont développés. L’autodifférenciation cartilagineuse n’est apparue que dans des explants prélevés sur des embryons se trouvant au stade de 25 à 26 somites. Nous pouvons donc conclure que les améliorations des cultures de mésenchyme somitique n’étaient pas dues à d’éventuelles traces d’albumine ou de vitellus restées sur la membrane vitelline.

Par ailleurs, on peut se demander si les améliorations constatées étaient dues à la seule utilisation de la membrane vitelline ou si la conjonction membrane vitelline et milieu enrichi en était responsable. Pour trancher ce problème, nous avons cultivé 50 explants de mésenchyme somitique entourés de la membrane vitelline sur le milieu standard. Huit explants seulement se sont nécrosés. La culture s’est donc trouvée améliorée mais la chronologie de l’autodifférenciation cartilagineuse n’a pas subi de transformations notables. Du cartilage s’est développé par autodifférenciation dans 10 explants sur 10 prélevés sur des embryons de 27 paires de somites ; dans 3 explants sur 5, prélevés sur des embryons de 26 paires de somites et dans 2 explants sur 5, prélevés sur des embryons du stade de 25 paires de somites. Les 22 explants restés indifférenciés provenaient d’embryons dont le stade était plus précoce que 25 paires de somites. L’emploi simultané du milieu standard et de la membrane vitelline améliore légèrement la culture, mais ne modifie guère la chronologie de la chondrogenèse. Ce résultat prouve que ce n’est pas l’utilisation de la membrane vitelline seule qui entraîne les modifications étudiées, mais qu’elles sont dues à la conjonction créée par l’emploi simultané du milieu enrichi et de la membrane vitelline.

Le problème que nous nous sommes proposé d’étudier dans cet article, était de savoir quelle peut être l’influence exercée par l’extrait actif des organes inducteurs de cartilage, par la composition du milieu nutritif et par la méthode de culture sur la chronologie de la chondrogenèse vertébrale à partir de mésenchyme somitique cultivé in vitro. In situ, en l’absence du tube nerveux et de la chorde, le mésenchyme somitique est incapable de se différencier en cartilage avant le stade de 27 à 30 paires de somites—stade 17 à 18 de Hamburger et Hamilton (Strudel, 1953, 1955; Watterson et al., 1954). La chronologie de la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique isolé est, par contre, un problème sur lequel les opinions des auteurs sont divergentes. Pour Hoadley (1925), Murray et Selby (1933), Williams (1942) ainsi que pour Seno et Büyükôzer (1958), du mésenchyme prélevé sur des embryons au stade de 20 ou de moins de 20 paires de somites (8 pour Seno et Büyükôzer) peut fournir du cartilage lorsqu’il est greffé sur un Poulet hôte. Watterson et al. (1954),Avery et al (1956). n’ont obtenu de la différenciation cartilagineuse qu’à partir de greffons prélevés sur des embryons de 3 jours. En culture in vitroAvery et al. (1956), Lash et al. (1957) ont montré que F autodifférenciation cartilagineuse peut déjà se faire à partir de mésenchyme somitique prélevé sur des embryons au stade de 17 à 18 de H. et H.

Ces différences laissent supposer que le milieu de l’hôte ou le milieu de culture exerce une influence sur la chondrogenèse du mésenchyme somitique isolé. Nous avons résumé les résultats de nos expériences concernant cette question dans le Tableau 3. Ces résultats montrent clairement l’influence de la composition du milieu nutritif, de la méthode de culture et de l’agent actif de l’extrait des organes inducteurs sur la chronologie de la chondrogenèse du mésenchyme somitique cultivé in vitro. Plus le milieu est riche du point de vue nutritif, plus précocement intervient l’autodiflerenciation du cartilage ainsi que l’induction cartilagineuse sous l’action de l’extrait des inducteurs. Toutefois, ni l’albumine, ni le vitellus ne semblent favoriser la chondrogenèse. Par contre, elle est favorisée par l’emploi simultané d’un milieu nutritif riche et d’un procédé mécanique (membrane vitelline) assurant une bonne cohésion des cellules de l’explant.

Tableau 3.

Influence du milieu nutritif et de l’inducteur sur la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique cultivé in vitro

Influence du milieu nutritif et de l’inducteur sur la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique cultivé in vitro
Influence du milieu nutritif et de l’inducteur sur la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique cultivé in vitro

Ainsi, nous voyons dans le Tableau 3 que l’âge minimal des explants faisant de la chondrogenèse par autodifférenciation va en s’abaissant en fonction de l’amélioration des conditions de culture. Du stade de 27 paires de somites l’âge minimal passe au stade 26 et 25 puis à celui de 17 somites. De même, l’âge minimal des explants faisant de la chondrogenèse sous l’action de l’agent actif de l’extrait des organes inducteurs passe, dans les mêmes conditions, du stade 20 à celui de 13 puis de 8 paires de somites. Il est important de noter que l’écart existant entre le stade de l’autodifférenciation cartilagineuse et celui de la chondrogenèse provoquée par l’extrait inducteur, est maintenu. En effet, dans les conditions de culture les plus favorables que nous ayons réalisées jusqu’à présent, l’autodifférenciation du cartilage n’apparaît que dans du mésenchyme somitique prélevé sur des embryons du stade de 17 paires de somites (stade 12 à 13 de H. et H.), tandis que la chondrogenèse induite par l’extrait inducteur s’opère déjà dans du mésenchyme somitique prélevé sur des embryons du stade de 8 paires de somites (stade 9 à 10 de H. et H.).

On ne peut, pour expliquer ces résultats, admettre que le jus pur d’embryon de 9 jours contient l’agent chondrogène du tube nerveux et de la chorde et, surtout, qu’il le contient à une concentration plus forte que le jus d’embryon dilué à 50 %. En effet, nous avons montré (Strudel, 1962a) que l’extrait de tube nerveux et de chorde d’embryon de 6, 7 et 8 jours n’est plus actif. Par ailleurs, l’autodifférenciation cartilagineuse des explants témoins, cultivés sur le milieu enrichi, ne s’opère, comme pour le milieu standard, que s’ils sont prélevés sur des donneurs se trouvant au minimum au stade de 27 paires de somites.

Ces modifications de la chronologie de la chondrogenèse ne peuvent toutefois se réaliser, que dans la mesure où la compétence du tissu réacteur subit des modifications analogues, c’est-à-dire devient également de plus en plus précoce. On peut d’ailleurs tout aussi bien admettre que la compétence du mésenchyme somitique à se différencier en cartilage existe de toute façon très précocement dans le tissu réacteur. Nous inclinons à penser que cette dernière éventualité est la bonne. Tout se passe, comme si le mésenchyme somitique était très précocement apte à se différencier en cartilage. Cette aptitude toutefois ne se révélerait que si le mésenchyme somitique est placé dans des conditions physiques et chimiques particulièrement favorables. De pareilles conditions semblent être celles que nous créons par l’utilisation du milieu enrichi et de la membrane vitelline. Ces conditions doivent être nettement meilleures que celles qui existent in ovo, puisque la chondrogenèse n’intervient dans le mésenchyme somitique, in situ, privé des organes inducteurs, qu’au stade de 27 à 30 paires de somites (stade 18 à 19 de H. et H.).

Si nous admettons l’aptitude du mésenchyme somitique à se différencier très précocement en cartilage, la diversité des résultats obtenus par les différents auteurs en ce qui concerne la chronologie de la chondrogenèse du mésenchyme isolé, se trouverait expliquée. L’influence de la composition du milieu de l’hôte ou du milieu de culture serait déterminante. Point ne serait nécessaire d’invo-quer, comme le font Stockdale et al. (1961), des phénomènes particuliers de régulation que subirait le mésenchyme somitique isolé et qui l’amèneraient ‘à former un type de structure différent de ce qu’il aurait produit s’il était resté in situ’, pour expliquer la chondrogenèse du mésenchyme somitique isolé, prélevé sur de jeunes embryons et greffé dans différentes régions d’un embryon hôte. Les résultats des expériences de greffes intracoelomiques de mésenchyme d’embryon de 9 paires de somites de Seno et Büyükôzer pourraient être inter-prétés de la même manière. Il est possible que l’on puisse améliorer de plus en plus les conditions de culture du mésenchyme somitique et arriver ainsi à mieux comprendre le mécanisme des phénomènes de l’induction et de l’autodifférenciation cartilagineuse. D’ores et déjà, on peut affirmer que dans le phénomène de la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique, c’est à la compétence du réacteur qu’il faut octroyer le rôle le plus important. L’inducteur ne semble que déclencher un mécanisme inscrit d’avance dans la destinée du réacteur.

Notre travail montre que le mécanisme de la différenciation cartilagineuse du mésenchyme somitique peut être évoqué par deux types de facteurs :

(a) par des facteurs alimentaires. Plus le milieu est riche, plus le mécanisme évocateur se fait précocement. On peut se demander quelle est la nature du rôle joué par les aliments dans la chondrogenèse ? Quelles interactions métaboliques déclenchent-ils, qui permettent la différenciation du mésenchyme en cartilage. Il est légitime de se demander si le rôle joué par les aliments est bien différent de celui qu’exerce l’inducteur;

(b) par le facteur actif contenu dans l’extrait des organes inducteurs. Nous supposons que le facteur actif est autre chose qu’un aliment, car, d’une part, son action se surajoute à celle exercée par les aliments, et, d’autre part, son pouvoir inducteur est plus puissant que le pouvoir évocateur des aliments. En effet, il agit sur du mésenchyme somitique beaucoup plus jeune, donc moins évolué chimiquement et sur des quantités de mésenchyme beaucoup plus faibles.1

  1. Il a été établi (Strudel et Watterson) qu’zn situ, en l’absence des organes inducteurs—tube nerveux et chorde—le mésenchyme somitique de l’embryon de Poulet ne se différencie en cartilage qu’à partir du stade de 27 à 30 somites. En culture in vitro sur un milieu à base de jus d’embryon de Poulet dilué ou pur l’autodifférenciation cartilagineuse ne s’effectue que dans du mésenchyme somitique prélevé sur des embryons de 27 paires de somites. Par contre, si le mésenchyme est enveloppé de la membrane vitelline et cultivé sur un milieu contenant du jus d’embryon pur, il s’autodifférencie dès le stade de 17 paires de somites.

  2. La différenciation en cartilage peut être obtenue à partir de mésenchyme prélevé sur des embryons plus jeunes si on incorpore de l’extrait des organes inducteurs (tube nerveux et chorde) au milieu de culture. Ainsi, sur le milieu à base de jus d’embryon dilué additionné d’extrait inducteur, la chondrogénèse s’opère dans du mésenchyme d’embryon de 20 paires de somites. Sur le milieu à base de jus d’embryon pur additionné d’extrait inducteur, la différenciation en cartilage s’effectue dans du mésenchyme somitique d’embryon de 13 paires de somites. Du mésenchyme somitique d’embryon de 8 paires de somites se différencie déjà en cartilage s’il est entouré de la membrane vitelline et cultivé sur le milieu à base de jus pur.

  3. Ces résultats montrent que la chronologie de la chondrogenèse à partir de mésenchyme somitique de Poulet cultivé in vitro, varie avec la composition du milieu nutritif et la méthode de culture. Ces variations de la chronologie de la chondrogenèse du mésenchyme somitique, cultivé in vitro, font admettre que l’aptitude du mésenchyme somitique à se différencier en cartilage doit exister très précocement. Cette aptitude précoce ne se manifeste toutefois que si le mésenchyme somitique est cultivé d’une part sur un milieu nutritif très favorable, et, d’autre part, en présence de l’extrait des organes inducteurs.

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Planche 1

Planche 1

Fig. 1. Coupe microscopique d’un expiant témoin cultivé sur le milieu standard. L’explant a été prélevé sur un embryon de 21 paires de somites et comprend les somites 12 à 21. E., Epithelium ± kératinisé; M., mésenchyme indifférencié; m., paquet de cellules musculaires; Tu., tube urinifère. .

Fig. 2. Coupe microscopique d’un expiant témoin prélevé sur un embryon de 23 somites et comprenant les somites 10 à 23. L’explant a été cultivé sur le milieu enrichi. E., épithélium ± kératinisé; M., mésenchyme indifférencié; m., paquet de cellules musculaires; Tu., tubes urinifères.

Fig. 3. Coupe microscopique d’un expiant témoin prélevé sur un embryon de 8 paires de somites et comprenant les somites 5 à 8. L’explant a été cultivé sur le milieu enrichi et est entouré de la membrane vitelline (Vi). Il ne possède pas de membrane limitante. M., mésenchyme indifférencié; K., nodule de tissu kératinisé.

Fig. 4. Coupe microscopique de l’explant expérimental prélevé comme l’explant précédent sur un embryon de 8 somites et comprenant les somites 5 à 8. Il est entouré de la membrane vitelline (Vi.) et a été cultivé sur le milieu enrichi additionné de l’extrait des organes inducteurs. M., Mésenchyme indifférencié; C., cartilage.

Planche 1

Fig. 1. Coupe microscopique d’un expiant témoin cultivé sur le milieu standard. L’explant a été prélevé sur un embryon de 21 paires de somites et comprend les somites 12 à 21. E., Epithelium ± kératinisé; M., mésenchyme indifférencié; m., paquet de cellules musculaires; Tu., tube urinifère. .

Fig. 2. Coupe microscopique d’un expiant témoin prélevé sur un embryon de 23 somites et comprenant les somites 10 à 23. L’explant a été cultivé sur le milieu enrichi. E., épithélium ± kératinisé; M., mésenchyme indifférencié; m., paquet de cellules musculaires; Tu., tubes urinifères.

Fig. 3. Coupe microscopique d’un expiant témoin prélevé sur un embryon de 8 paires de somites et comprenant les somites 5 à 8. L’explant a été cultivé sur le milieu enrichi et est entouré de la membrane vitelline (Vi). Il ne possède pas de membrane limitante. M., mésenchyme indifférencié; K., nodule de tissu kératinisé.

Fig. 4. Coupe microscopique de l’explant expérimental prélevé comme l’explant précédent sur un embryon de 8 somites et comprenant les somites 5 à 8. Il est entouré de la membrane vitelline (Vi.) et a été cultivé sur le milieu enrichi additionné de l’extrait des organes inducteurs. M., Mésenchyme indifférencié; C., cartilage.

Planche 2

Planche 2

Fig. 5. Coupe microscopique d’un expiant témoin provenant des somites 6 à 14 d’un embryon de 14 somites. Il est entouré de la membrane vitelline (Vi.) et a été cultivé sur lemilieu enrichi. Noter l’absence de cartilage. M., mésenchyme indifférencié; m., paquet de cellules musculaires.

Fig. 6. Coupe microscopique d’un expiant expérimental prélevé et cultivé dans les mêmes conditions que celui de la Fig. 5. Noter la différenciation de cartilage (C). Vi., membrane vitelline; M., mésenchyme indifférencié; C., cartilage; K., nodule de tissu kératinisé; Tu., tube urinifère.

Fig. 7. Coupe microscopique d’un expiant témoin provenant des somites 6 à 17 d’un embryon de 17 somites. Noter la formation de cartilage par autodifférenciation. Vi., membrane vitelline; M., mésenchyme indifférencié; C., cartilage; K., nodule de tissu kératinisé; L., lacune.

Fig. 8. Coupe microscopique d’un expiant expérimental prélevé et cultivé dans les mêmes conditions que le précédent (Fig. 7). Noter la différenciation presque complète du mésenchyme en cartilage et l’aspect histologique des deux masses de cartilage. Vi., membrane vitelline; M., mésenchyme indifférencié; C., cartilage; K., nodule de tissu kératinisé.

Planche 2

Fig. 5. Coupe microscopique d’un expiant témoin provenant des somites 6 à 14 d’un embryon de 14 somites. Il est entouré de la membrane vitelline (Vi.) et a été cultivé sur lemilieu enrichi. Noter l’absence de cartilage. M., mésenchyme indifférencié; m., paquet de cellules musculaires.

Fig. 6. Coupe microscopique d’un expiant expérimental prélevé et cultivé dans les mêmes conditions que celui de la Fig. 5. Noter la différenciation de cartilage (C). Vi., membrane vitelline; M., mésenchyme indifférencié; C., cartilage; K., nodule de tissu kératinisé; Tu., tube urinifère.

Fig. 7. Coupe microscopique d’un expiant témoin provenant des somites 6 à 17 d’un embryon de 17 somites. Noter la formation de cartilage par autodifférenciation. Vi., membrane vitelline; M., mésenchyme indifférencié; C., cartilage; K., nodule de tissu kératinisé; L., lacune.

Fig. 8. Coupe microscopique d’un expiant expérimental prélevé et cultivé dans les mêmes conditions que le précédent (Fig. 7). Noter la différenciation presque complète du mésenchyme en cartilage et l’aspect histologique des deux masses de cartilage. Vi., membrane vitelline; M., mésenchyme indifférencié; C., cartilage; K., nodule de tissu kératinisé.

1

Après que ce travail ait été envoyé à l’impression, nous apprenons la parution d’une publication de Lash, Hommes et Zilliken (1962) traitant de l’isolement d’un facteur chondrogène à partir du tube nerveux et de la chorde de l’embryon de Poulet.