ABSTRACT
A study has been made of the incorporation of nucleic acid precursors (thymidine, uridine, cytidine) in two embryonic materials: Pleurodeles and Chicken, in the presence of two substances known to have a morphostatic effect on the closure of the neural plate: β-mercaptoethanol and lipoic acid.
The results reveal a marked similarity of action. Thymidine incorporation into DNA is stimulated by mercaptoethanol and lipoic acid. Both substances also stimulate the incorporation of cytidine and uridine into RNA. But there is a difference in the case of DNA : mercaptoethanol has a slight stimulatory effect on the incorporation of the two nucleosides, whereas lipoic acid is definitely inhibitory.
All the evidence suggests a specific effect of lipoic acid on the reduction of ribonucleosides to deoxyribonucleosides.
The results have been discussed.
INTRODUCTION
L’Importance des groupes sulfhydriles (thiols, –SH) pour la morphogénèse a été mise en évidence par de nombreux auteurs (Rapkine et Brachet, 1951; Lallier, 1951; Brachet et Delange-Cornil, 1959; Brachet, 1959; Seilern-Aspang, 1959; Brachet, 1960; Pohl et Brachet, 1962; etc.).
Différentes interprétations ont été proposées à propos du mode d’action biochimique de ces agents. Voici, brièvement énoncées, les principales hypothèses qui ont été soulevées :
Le mercaptoéthanol, en rompant des ponts disulfures (–SS–) ou en formant un disulfure mixte, empêcherait le fonctionnement des protéines de structure du système nerveux, qu’on tend à assimiler à des protéines à –SH fibreuses et sans doute contractiles, comparables à l’actomyosine.
Le mercaptoéthanol pourrait agir au niveau d’une protéine enzymatique, une ATPase par exemple, requise pour la contraction des protéines constitutives de la plaque médullaire; cette hypothèse ne paraît pas se vérifier (Brachet, 1963).
Il ne semble pas non plus qu’une simple modification de l’équilibre –SH ⇋–SS– du milieu extérieur soit la cause de l’inhibition morphologique; en effet, les effets de deux disulfures, le dithiodiglycol et l’acide lipoïque, sont tout à fait différents (Brachet, 1963).
Des travaux récents de Bertani et coll. (1961), de Reichard et coll. (1961), de Stacey (1961), de Hurwitz et coll. (1960). et de Furth et coll. (1961), dont nous reparlerons plus loin, permettent de penser que le mercaptoéthanol pourrait agir sur la synthèse des acides nucléiques.
Quant à l’action de l’acide lipoïque, Henderson et Eakin (1960) pensent qu’il agirait, non en temps que coenzyme, mais comme inhibiteur du fonctionnement de la déshydrogénase malique.
Résumons rapidement maintenant ce qu’on sait effectivement sur le mode d’action biochimique de ces deux agents.
Brachet et coll. (1961) ont montré que le blocage morphologique sous l’effet du mercaptoéthanol (M/100) ne peut s’expliquer par une altération de la consommation d’oxygène ou de la formation d’ATP; de plus, l’activité de la cathepsine, enzyme protéolytique qui requiert l’intégrité de son groupe -SH pour son fonctionnement, n’est pas influencée, chez les gastrulas et les neurulas de Batraciens, par la présence de mercaptoéthanol. Les mêmes auteurs ont essayé de vérifier l’hypothèse de Henderson et Eakin sur l’action de l’acide lipoïque au niveau de la déshydrogénase malique, mais n’ont obtenu que des résultats négatifs.
Il est donc évident que l’effet morphostatique du mercaptoéthanol et de l’acide lipoïque ne peut recevoir d’explication biochimique simple; cela nous incite à croire que ces substances doivent agir sur des mécanismes hautement spécifiques. C’est pourquoi il nous a paru utile d’étudier les effets de ces deux substances sur la synthèse des acides nucléiques: en effet, nous savons que la morphogénèse est directement fiée à la synthèse de RNA spécifique au cours du développement embryonnaire (Brachet, 1960).
On sait cependant que l’effet primaire du mercaptoéthanol n’est de toute évidence pas l’arrêt de la synthèse des acides nucléiques (Brachet et coll., 1961; Quertier, 1962) mais une action plus subtile : par exemple la synthèse d’acides nucléiques anormaux ne peut être exclue.
C’est pourquoi nous avons repris, par la méthode autoradiographique, l’étude du comportement du DNA et du RNA dans les embryons traités par le mercaptoéthanol et l’acide lipoïque. La parfaite similitude des effets morphostatiques exercés par ces deux substances sur les embryons de Batraciens et sur les embryons de Poulet (Pohl et Brachet, 1962) nous a incitées à étudier ce problème parallèlement sur ces deux matériels.
MATÉRIEL ET MÉTHODE
Pleurodéles waltlii
Les expériences d’incorporation ont toutes été réalisées sur des explantats cultivés dans du milieu de Niu et Twitty (1953). Deux types d’expériences ont été poursuivis.
Le mercaptoéthanol (M/300) ou l’acide lipoïque (20 ou 30 jug/ml) sont ajoutés à des explantats de plaque médullaire. Les différents précurseurs radioactifs sont ajoutés au milieu de culture soit immédiatement, soit quelques heures après le début du traitement par le mercaptoéthanol ou l’acide lipoïque.
Le traitement par le mercaptoéthanol (M/300) ou l’acide lipoïque (20 μg/ml), commencé sur une gastrula avancée entière (stade du petit bouchon vitellin) est poursuivi jusqu’à la formation d’une plaque médullaire à peine soulevée et très largement ouverte. Cette esquisse de plaque neurale anormale est alors explantée et cultivée en présence de mercaptoéthanol ou d’acide lipoïque, additionné du précurseur marqué.
Les durées de traitement (par le mercaptoéthanol ou l’acide lipoïque) et les temps d’incubation en présence des précurseurs marqués varient d’une expérience à l’autre; ils seront précisés lors de l’exposé des résultats.
Poulet
Les embryons de Poulet sont mis à incuber à 38°C pendent 30 à 35 heures suivant la période de l’année. Ils sont ensuite explantés, au stade 7–8− de la table de Hamburger et Hamilton (1951), suivant la méthode de Spratt sur un milieu ‘Ringer-agar’ additionné de glucose, et de tampons au phosphate et au bicarbonate (milieu de Spratt, 1956).
2 à 3 ml de milieu de culture additionné ou non de mercaptoéthanol (M/100) ou d’acide lipoïque (20 ^g/ml), ainsi que du précurseur radioactif étudié, sont alors coulés dans un verre de montre, qui est lui-même posé dans une boîte de Pétri sur un fond d’ouate humide; un seul embryon est cultivé par boîte. Toutes les manipulations sont effectuées stérilement.
La liste des nucléosides marqués qui ont été utilisés comme précurseurs métaboliques est donnée dans le tableau suivant.
Les embryons des deux espèces ont été fixés à froid à l’alcool acétique (mélange 9/1) et enrobés dans la paraffine selon la méthode usuelle.
Les coupes à 10μ ont été recouvertes d’émulsion Ilford K2 selon le procédé décrit par Ficq (1955).
L’ hydrolyse acide de Feulgen (HCl,IN à 60°C pendant 5 min), de même que des tests enzymatiques à la ribonucléase et à la désoxyribonucléase, ont été effectués pour dissocier, dans le cas de précurseurs non spécifiques (Uridine et Cytidine), la part de la radioactivité revenant soit à l’ADN soit à l’ARN. Les autoradiogrammes étaient finalement colorés à l’Unna, à l’exception, bien entendu de ceux qui ont subi la réaction de Feulgen.
RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX
Vérification des effets morphostatiques du mercaptoéthanol et de Vacide lipoïque sur la neurulation
Pleurodéles
Une jeune plaque médullaire explantée met de 15 à 20 heures avant d’avoir effectué les mouvements de convergence dorsale qui mènent à la formation du tube neural clos.
Si on traite de tels explantats par du mercaptoéthanol (M/100 ou M/300) ou par de l’acide lipoïque (30 ou 20 μg/ml), on inhibe totalement, aux concentrations élevées et on ralentit fortement, aux concentrations faibles, la convergence et la fusion dorsales des lèvres de la plaque neurale. Le report des explantats dans un milieu normal permet une récupération sensible, même après un traitement long (une trentaine d’heures).
Lorsque le traitement par le mercaptoéthanol (M/300) ou l’acide lipoïque (20 /xg/ml) porte sur la gastrula intacte à petit bouchon vitellin, les explantats de la plaque médullaire perdent, après report dans le milieu normal, la capacité de former un tube neural clos lorsqu’ils ont subi un traitement dont la durée dépasse une vingtaine d’heures.
Le mercaptoéthanol et l’acide lipoïque semblent donc exercer des effets morphostatiques plus marqués lorsque le traitement porte sur l’œuf entier qui se prépare à neuruler que lorsqu’ils agissent directement sur de jeunes plaques médullaires. Ces résultats complètent, tout en les confirmant, ceux qui ont été décrits récemment par Malpoix et coll. (1963).
Poulet
L’embryon explanté au stade 7–8− (stade du prolongement céphalique avancé, un à deux somites) forme un système nerveux complet en 6 heures approximativement.
L’addition de mercaptoéthanol (M/100) ou d’acide lipoïque (20 μg/ml), dès le début de l’explantation, inhibe totalement cette formation; à ce moment, l’action de ces deux agents est encore réversible par simple report des embryons sur le milieu normal. Par contre, après 7 à 9 heures de traitement, le blocage de la fermeture du tube neural est définitif.
Enfin, après 17 à 20 heures de traitement, l’embryon entre progressivement en lyse dans le cas du milieu additionné de mercaptoéthanol; il résiste mieux à l’action de l’acide lipoïque.
Résultats autoradiographiques
Nous avons exprimé les résultats des expériences d’incorporation sous la forme de tablaux montrant, successivement chez le Pleurodèle et le Poulet, l’incorporation dans les explantats traités par rapport à celle observée dans les explantats témoins. Dans certains cas, ces tableaux ne donnent qu’une estimation grossière du noircissement des autoradiogrammes. Le plus souvent, heureusement, il a été possible de procéder à des comptages du nombre de grains d’émulsion sensibilisés par l’élément radioactif; le pourcentage de la variation de la radio-activité cellulaire des embryons traités par rapport aux témoins a été déterminé de la sorte.
Précisons que les présentes investigations sont limitées au système nerveux.
Dans les embryons de Pleurodèle, nous nous sommes bornées à la détermination de l’activité nucléaire; en effet, l’activité cytoplasmique est rendue difficilement appréciable par la présence de nombreux grains de pigment.
Dans les embryons de Poulet, nous avons mesuré la radioactivité globale (noyau et cytoplasme) des cellules du système nerveux.
Thymidine
L’incorporation de la thymidine 3H est, comme on pouvait s’y attendre, strictement localisée au niveau des noyaux. Un test à la déoxyribonucléase élimine la quasi totalité de la radioactivité.
On voit que chez le Poulet, comme chez le Pleurodèle, le mercaptoéthanol et l’acide lipoïque stimulent tous deux l’incorporation de la thymidine dans l’ADN. Cette conclusion est en parfait accord avec les observations précédentes de l’une de nous (Quertier, 1962).
Toutefois, après un très long traitement (42 heures, Batr.), cette stimulation rapide et importante ne se manifeste plus. A ce moment, le blocage de la fermeture neurale est irréversible.
Uridine
On voit que l’incorporation globale de l’uridine 3H est affectée en sens opposés par le mercaptoéthanol (stimulation) et par l’acide lipoïque (inhibition).
Lorsque l’on passe à l’examen des résultats des tests enzymatiques, on constate que:
Au niveau du DNA, tant le mercaptoéthanol que l’acide lipoïque provoquent une diminution de l’incorporation du ribonucléoside tritié; notons toutefois que l’effet de l’acide lipoïque est beaucoup plus marqué que celui du Mercaptoéthanol.
Au niveau du RNA, les deux agents agissent dans le sens d’une stimulation de l’incorporation.
Comme l’ont montré Bieliavsky et Tencer (1960), 1’uridine s’incorpore chez les neurulas de Batraciens, à la fois dans le DNA et dans le RNA. On voit qu’il en va de même chez le Poulet. On pouvait du reste s’y attendre puisque Reichard (1958) a observé qu’un extrait embryonnaire de Poulet permet in vitro la transformation de l’uridine en désoxyuridine (par réduction du ribose en désoxyribose).
Cytidine (voir page 300)
Il ressort clairement de l’examen des résultats que l’incorporation de la cytidine 3H évolue de manière très comparable à celle de l’uridine :
Au niveau du DNA, tandis que le mercaptoéthanol n’influence que faiblement l’incorporation de la cytidine, l’acide lipoïque l’inhibe nettement.
Au niveau du RNA, nous retrouvons une stimulation de l’incorporation tant sous l’effet du mercaptoéthanol que sous celui de l’acide lipoïque.
DISCUSSION
Il ressort, tout d’abord, des expériences qui viennent d’être relatées que les effets du mercaptoéthanol et de l’acide lipoïque sont très comparables chez les Batraciens et chez les Oiseaux : on peut donc conclure que l’action de ces deux substances n’est pas restreinte à un matériel embryologique particulier, mais qu’elle porte, au contraire, sur un mécanisme biologique fondamental.
Effets du mercaptoéthanol
Nous avons vu que le mercaptoéthanol influence, de façon appréciable, l’incorporation des trois précurseurs d’acides nucléiques utilisés.
La stimulation nette et précoce de l’incorporation de la thymidine dans le DNA est à rapprocher des travaux de Bollum et coll. (1960); ces auteurs ont noté un effet favorable du mercaptoéthanol sur le fonctionnement enzymatique de la thymidylatekinase (enzyme permettant la conversion du thymidinemonophosphate en thymidinetriphosphate). Or c’est le thymidinetriphosphate qui est vraisemblablement le précurseur direct du DNA. Par ailleurs, Stacey (1961) a signalé que la cystéine et, à un moindre degré le mercaptoéthanol activent la polymérase du DNA. Nos résultats pourraient donc résulter de la stimulation, sous l’effet du mercaptoéthanol, de l’un ou de l’autre de ces deux enzymes. Il s’agirait, dans cette hypothèse, d’une stimulation réelle de la synthèse du DNA. Mais nous ne pouvons exclure l’hypothèse d’un simple accrochage de la thymidine en bout de chaîne, qui serait favorisé par le mercaptoéthanol et l’acide lipoïque agissant in vivo.
Lorsque le temps de traitement est fortement prolongé (expériences sur le Pleurodèle), l’intensité de l’incorporation diminue progressivement. Il est possible que cet effet secondaire ne soit que la conséquence d’un ralentissement général du métabolisme de l’embryon, provoqué par la toxicité que manifeste, à la longue, le mercaptoéthanol.
Il ressort des observations autoradiographiques que l’incorporation de la cytidine et de l’uridine dans le DNA est, au contraire, peu influencée ou légèrement inhibée. Cette légère inhibition pourrait être mise en rapport avec un éventuel enrichissement du DNA en thymidine.
Quant aux stimulations importantes de l’incorporation de l’uridine et de la cytidine dans le RNA, la littérature laisse entrevoir deux éventualités:
Le mercaptoéthanol stimule in vitro l’incorporation en bout de chaîne du cytidinemonophosphate (et de l’adénosinemonophosphate) au niveau du RNA de transfert (Furth et Hurwitz 1961).
Le mercaptoéthanol favorise l’incorporation du cytidinemonophosphate (Hurwitz, 1959) et de l’uridinemonophosphate (Hurwitz et coll., 1960) dans les polyribonucléotides dont la synthèse enzymatique nécessite la présence de DNA (RNApolymérase dépendante de DNA). On sait que, selon Chamberlin et Berg (1962), le polyribonucléotide ainsi formé a une composition en bases complémentaire de celle du DNA ajouté comme amorceur.
Ces résultats nous portent à croire que le mercaptoéthanol pourrait, in vivo, influencer la synthèse des RNA qui interviennent dans le transfert des acides aminés, ou celle du RNA porteur de l’information génétique. Ajoutons que ces deux hypothèses ne s’excluent pas mutuellement.
L’impossibilité pour un embryon de former un tube neural après traitement au mercaptoéthanol peut donc trouver son explication dans un dérèglement des synthèses du DNA et du RNA: il se pourrait que le DNA formé en présence de mercaptoéthanol ait une composition en bases anormale et qu’il en résulte une anomalie dans la constitution du RNA messager, qui serait dès lors incapable de transmettre une information correcte.
On ne peut cependant pas éliminer une action directe du mercaptoéthanol sur la polymérase du RNA, qui entraînerait, elle aussi, la synthèse d’un RNA anormal et une altération de la synthèse des protéines.
Notons enfin que des expériences, faites dans le laboratoire du Prof. Errera, sur des cultures de cellules d’HeLa, semblent indiquer que le transfert du RNA du noyau vers le cytoplasme serait inhibé lorsque ces cellules sont cultivées en présence de mercaptoéthanol. Un phénomène de ce genre serait parfaitement compatible avec la synthèse d’un RNA messager anormal, incapable de quitter le noyau, comme l’ont suggéré Brachet et coll. (1962) dans le cas des hybrides létaux de Batraciens.
Effets de Vacide lipoïque
Les résultats que nous avons obtenus démontrent clairement que l’acide lipoïque affecte, même in vivo, le métabolisme des acides nucléiques.
Il convient de rappeler, à ce propos, les travaux de Bertani et coll. (1961) et de Reichard et coll. (1961). Etudiant, in vitro, la formation de désoxyribo-nucléotides à partir de ribonucléotides, ces auteurs ont pu montrer que l’acide lipoïque réduit favorise nettement la réduction de Turidinediphosphate en désoxyuridine-diphosphate, et celui du cytidinediphosphate en désoxycytidine-diphosphate.
Cette action semble très spécifique, puisque ni le glutathion, ni l’acide ascorbique, ni différentes combinaisons de nucléotides réduits ou oxydés etc…. ne sont susceptibles de jouer le même rôle.
Dans nos expériences, l’acide lipoïque a été utilisé sous sa forme oxydée; il n’est donc pas impossible à priori qu’il inhibe la réduction du ribose: en fait, tous nos résultats plaident dans ce sens.
Quant à la stimulation nette de l’incorporation de la thymidine dans le DNA des embryons traités par l’acide lipoïque, elle pourrait correspondre à une compensation de l’apport insuffisant de thymidine à partir d’uridine.
Il est, en tout cas, hors de doute que l’acide lipoïque, administré aux embryons vivants, constitue un réactif de choix pour séparer l’un de l’autre les deux chemins métaboliques (à partir des ribo-et des désoxyribonucléosides respectivement) qui conduisent à la synthèse du DNA.
RÉSUMÉ
L’effet du β-mercaptoéthanol et de l’acide lipoïque, qui exercent tous deux une action morphostatique nette sur la fermeture de la plaque médullaire, a été étudié au point de vue de leur influence sur l’incorporation de différents précurseurs des acides nucléiques (thymidine, uridine, cytidine) chez deux matériels embryologiques : le Pleurodèle et le Poulet.
La similitude des résultats obtenus sur ces deux matériels est évidente. L’incorporation de la thymidine dans le DNA est nettement stimulée tant par le mercaptoéthanol que par l’acide lipoïque. Ces deux agents stimulent aussi l’incorporation de 1’uridine et de la cytidine dans le RNA. Par contre, au niveau du DNA, l’action du mercaptoéthanol diffère de celle de l’acide lipoïque : le mercaptoéthanol stimule faiblement l’incorporation de ces deux nucléosides, tandis que l’acide lipoïque présente une action inhibitrice nette.
Tout porte à croire que l’acide lipoïque aurait une action spécifique sur la réduction des ribonucléosides en désoxyribonucléotides.
L’ensemble de ces résultats a été discuté.
REMERCIEMENTS
Nous tenons à exprimer toute notre gratitude à l’European Office Air Research and Development Command, U.S. Air Force pour leur aide financière (Contrat AF 61 (052-356)).